WWW.PDF.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Разные материалы
 

Pages:   || 2 |

«Реакция организма здоровых животных и животных с асцитной карциномой Эрлиха на воздействие сверхвысокочастотного электромагнитного излучения ...»

-- [ Страница 1 ] --

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«Сибирский федеральный университет»

Федеральное государственное бюджетное учреждение наук

и

«Красноярский научный центр

Сибирского отделения Российской академии наук»

На правах рукописи

Круглик Ольга Витальевна

Реакция организма здоровых животных и животных с

асцитной карциномой Эрлиха на воздействие

сверхвысокочастотного электромагнитного излучения

03.02.08 (экология) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

д.ф.-м.н., профессор Р.Г. Хлебопрос Красноярск, 2014 Список использованных сокращений АКЭ – асцитная карцинома Эрлиха АФК – активные формы кислорода БТШ – белок теплового шока ВДД – волны дециметрового диапазона ВМП – внешнее магнитное поле ВОЗ – Всемирная организация здравоохранения Г6ФДГ – глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа ГМП – геомагнитное поле ГР – глутатионредуктаза ЛДГ – лактатдегидрогеназа МПД – мощность поглощенной дозы НАД – никотинамиддинуклеотид НАДГДГ – НАД-зависимая глутаматдегидрогеназа НАДИЦДГ – НАД-зависимая изоцитратдегидрогеназа НАДМДГ – НАД-зависимая малатдегидрогеназа НАДФ – никотинамиддинуклеотидфосфат НАДФГДГ – НАДФ-зависимая глутаматдегидрогеназа НАДФМДГ – НАДФ-зависимая малатдегидрогеназа Обр.ЛДГ – лактатдегидрогеназа для обратной реакции Обр.НАДГДГ – НАД-зависимая глутаматдегидрогеназа для обратной реакции Обр.НАДМДГ – НАД-зависимая малатдегидрогеназа для обратной реакции Обр.НАДФГДГ – НАДФ-зависимая глутаматдегидрогеназа для обратной реакции ПДУ – предельно допустимые уровни ППЭ – плотность потока энергии СOД – супероксиддисмутаза СВЧ – сверхвысокочастотный диапазон ЦТК – цикл трикарбоновых кислот ЭМИ – электромагнитное излучение ЭМП – электромагнитное поле Содержание Введение



Глава 1. Общая характеристика неионизирующего электромагнитного излучения как фактора окружающей среды

1.1. Естественные электромагнитные поля

1.2. Источники электромагнитного излучения антропогенного происхождения13 Биологическое действие электромагнитных излучений 1.4.

сверхвысокочастотного диапазона на разных уровнях организации биологических систем

1.5. Механизмы действия электромагнитного поля сверхвысокочастотного диапазона на клетки

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Объект исследования

2.1.1. Лабораторные животные

2.1.2. Характеристика штамма асцитной карциномы Эрлиха

2.2. Источники электромагнитного излучения СВЧ-диапазона, используемые в эксперименте

2.3. Биофизические методы исследования

2.3.1. Измерение микровязкости мембран клеток асцитной карциномы Эрлиха

2.3.2. Метод перфузии изолированной печени крыс

2.4. Биохимические методы исследования

2.4.1. Определение содержания кислорода и углекислого газа в выдыхаемой животным газовой смеси

2.4.2. Определение содержания кислорода, углекислого газа, глюкозы и лактата в периферической крови животных

2.4.3. Определение содержания глюкозы и лактата в оттекающем от органа перфузате

2.4.4. Биолюминесцентное определение активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в клетках

2.4.6. Определение уровня генерации активных форм кислорода методом хемилюминесцентного анализа





2.5. Цитологические методы

2.5.1. Определение жизнеспособности клеток опухоли

2.5.2. Приготовление и окраска препаратов

2.6. Статистическая обработка результатов

Глава 3. Результаты исследования и обсуждение

3.1. Реакция организма здорового животного и животного с асцитной карциномой Эрлиха на действие ЭМИ СВЧ-диапазона

Влияние ЭМИ СВЧ-диапазона на функциональную активность 3.2.

изолированной перфузируемой печени крыс

3.3. Физиологические и метаболические изменения клеток в суспензии в ответ на воздействие ЭМИ СВЧ-диапазона

Заключение

Выводы

Использование полученных результатов и практические рекомендации............... 98 Список использованной литературы

Введение Актуальность работы.

В формировании живых организмов в процессе эволюции важная роль отводится электромагнитным полям природного происхождения. В современном мире в окружающей среде крупных городов происходят изменения естественного электромагнитного фона за счет увеличения электромагнитной нагрузки в результате активного развития и внедрения в повседневную жизнь новых теле- и радиокоммуникационных технологий, в частности, систем мобильной сотовой связи [1–10]. Авторы [4, 5] отмечают, что существующие дозиметрические характеристики для оценки нового потока электромагнитного воздействия на окружающую среду уже малопригодны и нормирование ЭМИ должно иметь иной характер. Так, Всемирной организацией здравоохранения проблема изучения последствий влияния на живые объекты электромагнитных полей в диапазоне частот работы системы сотовой связи выделена как приоритетная.

Одним из побудительных мотивов к экспериментальному исследованию влияния ЭМИ СВЧ-диапазона на организм млекопитающих в лабораторных условиях послужил анализ данных по расчету коллективной и индивидуальной электромагнитной нагрузки в Красноярске, показавший, что с одной стороны с 2002 по 2006 гг. произошло увеличение площади ЭМ загрязнения, с другой, при снижении индивидуальной нагрузки в основном за счет повышения качества выпускаемых средств связи, имеется тенденция к увеличению коллективной нагрузки на территории города [11]. Было также показано, что на территории Красноярска доля базовых станций сотовой связи среди других источников электромагнитного излучения радиочастотного диапазона составляет 80 % [12].

В связи с этим актуальным является изучение реакций организма млекопитающих на изменяющийся уровень электромагнитного фона окружающей среды для оценки рисков нарушения гомеостаза организма и возникновения заболеваний. Несмотря на большое количество исследований по влиянию СВЧизлучения на организм животных и человека, вопрос об уровне его вреда для здоровья, особенно при малых мощностях, остается открытым [8, 13–22]. С другой стороны, в большинстве работ рассматривается реакция здорового организма на воздействие ЭМИ, а то, каким образом ведет себя организм в патологическом состоянии при изменении электромагнитной нагрузки радиочастотного диапазона, изучено крайне мало.

Цель работы – выявление особенностей энергетического метаболизма здоровых животных и животных-опухоленосителей при адаптации к действию электромагнитного излучения сверхвысокочастотного диапазона.

Задачи:

1. Определить показатели энергетического обмена у здоровых животных и животных с асцитной карциномой Эрлиха, подвергшихся воздействию электромагнитного излучения сверхвысокочастотного диапазона.

2. Определить ключевые параметры метаболической адаптации изолированной перфузируемой печени крыс после воздействия электромагнитного излучения сверхвысокочастотного диапазона.

3. Оценить адаптационные возможности клеток асцитной карциномы Эрлиха и гепатоцитов в динамике развития опухолевого процесса под действием электромагнитного излучения сверхвысокочастотного диапазона.

заключается в установлении особенностей Научная новизна энергетического обмена у здоровых животных и животных-опухоленосителей в условиях действия абиотического фактора окружающей среды – электромагнитного излучения сверхвысокочастотного диапазона. Показано наличие адаптации к действию электромагнитного излучения в диапазоне частот работы системы сотовой связи у здоровых животных и ее отсутствие у животных с асцитной карциномой Эрлиха.

Получены новые данные по жизнеспособности и функциональной активности гепатоцитов и клеток асцитной карциномы Эрлиха в динамике развития опухоли в ответ на действие электромагнитного излучения в диапазоне частот работы системы сотовой связи.

Впервые проведен комплексный анализ влияния электромагнитного излучения сверхвысокочастотного диапазона одновременно на разных уровнях организации биологических систем: от уровня целого организма до уровня клетки.

Положения, выносимые на защиту:

1. В процессе адаптации к электромагнитному излучению сверхвысокочастотного диапазона (1 ГГц, ППЭ 70 мкВт/см2) у здоровых животных происходит включение в энергетический метаболизм в качестве основного субстрата белков, а у животных-опухоленосителей – липидов.

2. Увеличение времени воздействия электромагнитного излучения сверхвысокочастотного диапазона (1 ГГц, ППЭ 70 мкВт/см2) на организм приводит к развитию адаптивного ответа в печени здоровых крыс в виде повышения генерации активных форм кислорода в клетках печени, при этом изменения функций печени отсутствуют.

Теоретическая значимость заключается в выявлении метаболических и физиологических изменений, возникающих в организме, как у здоровых животных, так и у животных с асцитной карциномой Эрлиха под действием низкоинтенсивного СВЧ-излучения в диапазоне частот работы сотовой связи.

Полученные результаты могут способствовать пониманию механизмов адаптации и поддержания гомеостаза на разных уровнях организации биологических систем в состоянии нормы и при патологии в меняющихся условиях окружающей среды.

Полученные результаты могут быть Практическая значимость.

использованы при разработке новых нормативных документов по электромагнитной нагрузке в диапазоне частот сотовой связи, мер профилактики и регламентов работы технического персонала, обслуживающего базовые станции.

По теме диссертационного исследования Апробация результатов.

опубликовано 18 научных работ, из которых 4 – в журналах, предусмотренных перечнем ВАК РФ.

Основные результаты работы были представлены на XIII Международном симпозиуме «Сложные системы в экстремальных условиях» (4–10 сентября 2006 г., Красноярск, Россия); XIV Всероссийском симпозиуме с международным участием «Сложные системы в экстремальных условиях» (23–28 июня 2008 г., природный парк «Ергаки», Красноярский край, Россия); II съезде физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека» (29–31 октября 2008 г., Кишинев, Молдова); VII Международной конференции «Идентификация систем и задачи управления» (28–31 января 2008г., Москва, Россия); III Международного молодежного медицинского конгресса «Санкт-петербургские научные чтения – 2009» (2-4 декабря 2009г., С-Петербург, Россия); XV Всероссийском симпозиуме с международным участием «Сложные системы в экстремальных условиях», 16– 21 августа, 2010 г., Красноярск, Россия); 2 Всероссийской научно-практической конференции «Физиология адаптации» (22–24 июня 2010 г., Волгоград, Россия);

III съезде физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека» (1–6 октября 2011 г., Ялта, Украина); XVI Всероссийском симпозиуме с международным участием «Сложные системы в экстремальных условиях» (20–23 мая 2012г., Красноярск, Россия); Международной научной конференции «Фундаментальные науки – медицине» (17 мая 2013 г., Минск, Беларусь); Международной научнопрактической конференции жизнедеятельности: психологоБезопасность педагогические и медико-биологические аспекты» (27–28 ноября 2013 г., Ярославль, Россия).

Структура диссертации. Диссертация изложена на 118 страницах машинописного текста, состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и списка использованных литературных источников.

Работа иллюстрирована 43 рисунками и 6 таблицами. Список использованной литературы состоит из 161 источника, из них – 79 отечественных и 82 зарубежных.

Личный вклад автора. Автору принадлежит определяющая роль в постановке задач исследования. Экспериментальные исследования, анализ полученных результатов, приведенных в диссертационной работе, выполнены автором лично в рамках базовых проектов фундаментальных исследований II.9.2.5. «Исследование закономерностей динамики смены клеточных популяций в системе крови» и II.11.2.1. «Физические характеристики функционирования системы крови» Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Красноярский научный центр Сибирского отделения Российской академии наук».

Автор выражает благодарность научному руководителю Рему

– Григорьевичу Хлебопросу, сотрудникам лаборатории Международного научного центра исследований экстремальных состояний организма при Президиуме КНЦ СО РАН и отдельно сотрудникам сектора иммунологии Галине Владимировне Макарской и Светлане Вениаминовне Тарских, а также доценту кафедры Радиофизики Института инженерной физики и радиоэлектроники СФУ Алексею Филипповичу Копылову.

Глава 1. Общая характеристика неионизирующего электромагнитного излучения как фактора окружающей среды К неионизирующим электромагнитным излучениям принято относить электромагнитные излучения оптического и радиочастотного диапазона, а также условно-статические электрические и постоянные магнитные поля, излучениями не являющиеся.

Электромагнитные излучения (ЭМИ) распространяются в виде электромагнитных волн, характеризующихся: длиной волны, частотой колебаний (Гц) и скоростью их распространения (м/с) [23, 24]. Шкала электромагнитных волн представлена на рисунке 1.

Рисунок 1 – Шкала длин волн, частот и диапазонов излучения [Цит. по 25, с.112]

1.1. Естественные электромагнитные поля Электромагнитное излучение с точки зрения экологии является важным абиотическим фактором, под действием которого в процессе эволюции сформировались живые организмы [26].

В настоящее время электромагнитный фон Земли представляет собой совокупность естественного и искусственного излучения. Естественные ЭМП подразделяют на поля земного и внеземного происхождения. К внеземным в первую очередь относят радиоизлучение солнечной атмосферы в диапазоне волн от долей миллиметра до нескольких километров. Радиоизлучение Солнца на волнах длиннее нескольких километров практически полностью поглощается в межпланетном газе и недоступно наблюдениям. [27, 28].

Коротковолновое излучение Солнца относительно слабо; оно выходит из хромосферы, расположенной над видимой поверхностью Солнца. Солнечная атмосфера всегда испускает невидимое коротковолновое излучение, которое бывает особенно мощным в годы максимума солнечной активности: в это время ультрафиолетовое излучение возрастает примерно в два раза, а рентгеновское – в десятки и сотни раз. Ультрафиолетовое и рентгеновское излучения частично ионизуют слои земной атмосферы, образуя на высотах 200–500 км от поверхности Земли ионосферу. Состояние ионосферы меняется в зависимости от условий освещения ее Солнцем и от происходящих на нем явлений [23, 27].

Излучение, исходящее от Солнца и достигающее поверхности Земли, – основной источник энергии для поддержания теплового баланса окружающей среды, создания и превращения органических веществ автотрофным звеном биосферы, что в конечном итоге делает возможным формирование среды, способной удовлетворять жизненные потребности организмов, сформировавшиеся в процессе эволюции. Специфическое значение светового фактора заключается в том, что интенсивность и закономерная (суточная и сезонная) динамика условий освещения играет важную роль в регуляции периодических явлений в жизни представителей органического мира [26].

Ряд геофизических явлений (магнитные бури, т.е. кратковременные изменения магнитного поля Земли, полярные сияния и др.) тоже связан с изменением солнечной активности. Но эти явления происходят через сутки после вспышек на Солнце. Вызываются они не электромагнитным излучением, доходящим до Земли через 8,3 мин, а корпускулами (протонами и электронами, образующими разреженную плазму), которые с опозданием (на 1–2 сутки) проникают в околоземное пространство, поскольку движутся со скоростями 400 – 1000 км/с. Это явление названо солнечным ветром, источник которого – непрерывно расширяющаяся солнечная корона. [27].

Геомагнитное поле Земли характеризуется неоднородной (ГМП) пространственной структурой и широким спектром вариаций. Это объясняется тем, что оно создаётся за счёт источников различной природы. Магнитное поле Земли создается в основном благодаря действию источников, расположенных внутри Земли, а также в магнитосфере и ионосфере [29, 30].

Взаимодействие потока заряженных частиц (солнечного ветра) с ГМП приводит к образованию в пространстве, окружающем Землю, магнитосферы, в пределах которой возникают сложные токовые системы, создающие внешнее магнитное поле (ВМП). Эта часть поля наиболее динамична, его изменения имеют период от долей секунд до 11 лет и связаны с изменением солнечной активности. Существуют земные ЭМП, возбуждаемые разрядами молний в волновод, образованном в пространстве между поверхностью Земли и нижними слоями ионосферы [24].

В последнее время все большую долю влияния на живые организмы имеют ЭМП антропогенного происхождения, изменяющие привычную среду обитания.

1.2. Источники электромагнитного излучения антропогенного происхождения Рост общего электромагнитного фона Земли за период с конца XIX по начало XXI века составил от ~10-24–10-12 Вт/м2 до ~10–1–10 Вт/м2 [23]. В данный процесс существенный вклад внесло интенсивное развитие беспроводных технологий передачи данных [31]. В 1995 г. Всемирной Организацией Здравоохранения (ВОЗ) был принят термин «глобальное электромагнитное загрязнение окружающей среды», что включило эту проблему в перечень приоритетных для человечества. А в 2011 г. Международное агентство исследования рака при ВОЗ классифицировало радиочастотные (IARC) электромагнитные поля, связанные работой мобильной сотовой связи, как возможный канцерогенный фактор для населения [32, 33] Источники антропогенных ЭМП, как правило, генерируют излучение, которое в некоторых случаях превышает максимальный природный электромагнитный фон. Авторы [34] предлагают следующую классификацию антропогенных источников ЭМП:

Системы производства, передачи, распределения и потребления 1.

электроэнергии постоянного и переменного тока: электростанции, линии электропередачи, трансформаторные подстанции, системы электроснабжения и т.д.

Транспорт на электроприводе (0–3 кГц): железнодорожный транспорт 2.

и его инфраструктура, городской транспорт – метрополитен, троллейбусы, трамваи и т. п.

Функциональные передатчики: радиовещательные станции;

3.

телевизионные передатчики; базовые станции (БС) систем подвижной (в т.ч.

сотовой) радиосвязи; наземные станции космической связи; радиорелейные станции; радиолокационные станции и т. п.

Широкое применение ЭМИ СВЧ-диапазона нашло в научных исследованиях, радиолокации, спутниковой связи, термообработке пищевых продуктов и широко используется для мобильной сотовой связи. Кроме различных радиосистем военного назначения, во всех странах мира имеются многочисленные коммерческие линии связи, основанные на передаче информации посредством СВЧ. Поскольку такие радиоволны не следуют за кривизной земной поверхности, а распространяются по прямой, эти линии связи, как правило, состоят из ретрансляционных станций, установленных на вершинах холмов или на радиобашнях с интервалами около 50 км. Параболические или рупорные антенны, смонтированные на башнях, принимают и передают СВЧсигналы дальше. На каждой станции перед ретрансляцией сигнал усиливается электронным усилителем. Поскольку СВЧ-излучение допускает узконаправленные прием и передачу, больших затрат электроэнергии для передачи не требуется [23, 24, 30].

Оценивая электромагнитную среду города, авторы [29] считают, что необходимо учитывать структуру, интенсивность, частотный диапазон и степень модуляции источников ЭМП. Особенно неблагоприятная электромагнитная среда может создаваться вокруг радио- и телепередающих центров старой постройки с высотой антенной опоры не более 180 м. В районах жилой застройки, прилегающих к зонам аэропортов, население может подвергаться дополнительному влиянию радиолокационных станций.

Источниками ЭМИ, вносящими существенный вклад в загрязнение среды городов, являются базовые станции систем сотовой связи, располагающиеся на всей территории города и работающие в СВЧ диапазоне (длины волн от 30 см до 1мм и частота 3–300 ГГц). При работе базовых станций мобильной связи имеет место хроническое облучение всех групп населения сложноорганизованным модулированным ЭМП широкого спектра.

Исследования, проведенные на территории Красноярска, показали увеличение коллективной нагрузки ЭМИ СВЧ, рассчитанной с учетом излучения сотовых телефонов и базовых станций систем сотовой связи, на население при снижении уровня индивидуальной нагрузки в период с 1997 по 2006 гг. Показано также, что ПДУ каждого отдельно объекта систем сотовой связи не превышен [12].

На территории РФ приняты нормативные документы, устанавливающие предельно допустимые уровни (ПДУ) воздействия ЭМИ СВЧ на человека, оцениваемые в интенсивностях (плотностях потока энергии, Вт/см2 – ППЭ) (таблица 1), в зарубежной литературе для оценки уровня воздействия ЭМИ СВЧ используется удельный коэффициент поглощения (SAR), измеряемый в Вт/кг [35, 36]. В качестве нормируемого параметра в стандартах и руководствах безопасности SAR отражает наиболее объективный характер распространения и поглощения энергии ЭМИ в тканях. Данный подход успешно реализован в современных системах дозиметрии, введен в систему стандартизации и действующие Международные стандарты безопасности. Вместе с этим нельзя не признать, что SAR не всегда отражает реальные механизмы взаимодействия ЭМИ с биологическими тканями [5, 37].

–  –  –

Имеются существенные расхождения между Россией и рядом европейских стран и США в научных подходах к нормированию электромагнитных полей сверхвысоких частот, что приводит к расхождению ПДУ интенсивностей в СВЧдиапазоне в 100 и даже 1000 раз. Эти различия прежде всего связаны с различиями в оценке рисков развития неблагоприятных последствий в результате влияния электромагнитного излучения нетепловой интенсивности (до 1 мВт/см2) [14].

В оценке биологического эффекта и отдаленных последствий важную роль занимает количественная оценка доз излучения. Дозиметрическая оценка необходима не только для количественного описания величины поглощенной энергии, но и для дальнейшего обоснования экстраполяции на человека биологических эффектов облучения, тестируемых на животных [5]. В настоящее время фундаментальных научных данных для оценки электромагнитной безопасности мобильной сотовой связи, работающей в диапазоне СВЧ, недостаточно, а существующие экспериментальные данные разнородны и противоречивы.

1.4. Биологическое действие электромагнитных излучений сверхвысокочастотного диапазона на разных уровнях организации биологических систем Электромагнитные поля не обладают ионизирующей способностью и в биологических объектах воздействуют на уже имеющиеся свободные заряды или диполи. Какие-либо значимые последствия для биологической системы может иметь только поглощенное излучение. Известно, что большая часть поглощенной энергии превращается в тепловую [39], которая отвечает за большинство реакций, наблюдаемых в биологических системах в ответ на воздействие. Показано, что низкоинтенсивное СВЧ-излучение не вызывает нагрева тканей. Однако параметры жизнедеятельности организма в ответ на воздействие ЭМИ СВЧ изменяются достаточно часто.

Существует большое количество работ как отечественных, так и зарубежных авторов, посвященных анализу экспериментальных данных, описывающих воздействие на биологические системы различного вида неионизирующих излучений. В подавляющем большинстве работы связаны с влиянием полей относительно низких уровней интенсивности (магнитного, КВЧ, УВЧ, СВЧ) [40–49]. При этом единого мнения о механизмах воздействия ЭМИ СВЧ-диапазона нет, поэтому этот вопрос до сих пор остается открытым.

Существуют данные о том, что хроническое воздействие ЭМП радиочастотного диапазона (РЧ) при определенных параметрах оказывает как стимулирующее, так и угнетающее действие на структурные компоненты биосистем (животных, растений, насекомых, почвенные микроорганизмы).

Последствиями таких воздействий могут быть подавление или стимуляция роста растений, усиление или ингибирование размножения насекомых, в том числе вредителей, изменение активности почвенных микроорганизмов и поражение растений грибковыми заболеваниями, снижение репродуктивности животных [50, 51].

Выявлено, что ЭМИ на частоте мобильной связи (1 ГГц) вызывает серьезные функциональные расстройства у одноклеточных гидробионтов инфузорий Spirostomum Ambiguum – снижение спонтанной двигательной активности. При этом имеет место необычная форма биологической реакции – эффект является пороговым, массовым и не зависит от продолжительности СВЧоблучения [52].

Основное внимание исследователей, как правило, сосредоточено на оценке влияния ЭМП на нервную систему и нервные клетки. Важность этих исследований возросла с развитием мобильной сотовой связи и увеличением числа пользователей сотовых телефонов, среди которых большую долю составляют дети [14,16, 22, 53].

В работе [54] проведен сравнительный анализ и математическое моделирование чувствительности лабораторных животных (мыши, крысы) к СВЧ-облучению в зависимости от плотности потока энергии (ППЭ) и мощности поглощенной дозы (МПД). Были получены результаты, представленные в виде зависимостей продолжительности жизни животных различных видов в процессе облучения от ППЭ и МПД СВЧ излучения (0,46; 2,4 и 7 ГГц). Показано, что, если в качестве дозиметрического параметра использовать ППЭ, чувствительность животных к воздействию поля СВЧ возрастает с ростом массы животных. При использовании в качестве дозиметрического параметра МПД последовательность расположения животных по их чувствительности к СВЧ-излучению становится прямо противоположной. Также проведены исследования влияния ЭМИ РЧ на когнитивную функцию крыс в период полового созревания (2 мес.) и в возрасте морфофункциональной зрелости (3,5 мес.). Животных подвергали воздействию импульсного потока электромагнитной энергии частотой 925 МГц, частотой следования импульсов и скважностью в соответствии с сигналом подвижной станции мобильной связи стандарта GSM. В результате было выявлено, что воздействие ЭМИ РЧ в период полового созревания не приводит к изменению когнитивной функции, связанной с пространственной ориентацией, и вызывает улучшение когнитивной функции, связанной со зрительным восприятием, а в период морфофункциональной зрелости не приводит к изменению когнитивной функции, связанной со зрительным восприятием, но вызывает улучшение когнитивной функции, связанной с пространственной ориентацией [55].

Показано модифицирующее влияние низкоинтенсивного ЭМП на характер проявления у мышей поведенческих навыков и проявление адаптационной реакции [56].

В работах [57–60] авторы делают вывод о нейропротекторном эффекте на кортикальных клетках мозга при длительном воздействии ЭМИ (частота 900 МГц, стандарт GSM), предполагая, что полученные данные могут быть потенциальной нефармакологической стратегией при лечении болезни Альцгеймера. В подтверждение данных работ [57–59] можно рассматривать исследование [61] о благоприятном действии СВЧ излучения (частота 900 МГц, стандарт GSM) на смешанную культуру кортикальных клеток мозга эмбрионов крыс, где показана устойчивость и улучшение функций нейронов. Показано, что как у трансгенных животных с болезнью Альцгеймера, так и в культуре клеток мозга нейропротекторный эффект связан с изменением функционирования митохондрий при снижении уровня свободных радикалов в тканях мозга.

Влияние нового формата работы сотовых телефонов – 3G на клетки головного мозга описан в работе [6].

Результаты работы показывают, что ЭМП, генерируемое мобильным телефоном в формате 3G, вызывает кратковременное повышение уровня фосфорилирования БТШ27, БТШ70 и р38 митогенактивируемой протеинкиназы, что приводит к митохондриальной дисфункции:

опосредованному высвобождению цитохрома с и последующей активации каспаз, вовлеченных в процесс апоптоза. Исследование показывает, что окислительный стресс является основным фактором, который активирует различные путей передачи сигнала, в том числе БТШ27/p38MAPK. Авторы предполагают, что использование мобильного телефона в формате 3G может привести к ряду неврологических расстройств у абонентов системы сотовой связи [62].

Экспериментальными исследованиями на крысах с моделированным инфарктом миокарда показано, что воздействие волн дециметрового диапазона на область сердца повышает кровенаполнение сосудов (ВДД) микроциркуляторного русла миокарда и скорость кровотока в них, увеличивает количество функционирующих сосудов Отчетливо проявилась [48].

однонаправленность вазодилататорных реакций при воздействии ВДД разной локализации: на область сердца и рефлекторно-сегментарную зону, что свидетельствует не о местном, а о генерализованном характере ответной реакции.

Генерализованная вазодилатация, вызванная ВДД, по-видимому, является одним из механизмов снижения периферического сопротивления сосудов, обычно компенсаторно повышенного при сердечной недостаточности даже в начальных стадиях По мнению авторов, определенная роль в перестройке [63].

периферической и регионарной гемодинамики под влиянием ВДД принадлежит изменениям вегетативной регуляции – доминированию парасимпатической регуляции над симпатической, что приводит к снижению тонуса артериолярных и венулярных отделов микроциркуляторного русла.

Авторами показано [64] отклонение в деятельности щитовидной железы.

При длительном облучении ЭМП МГц) у крыс наблюдается (2375 антимутагенный эффект, выражающийся в понижении уровня хромосомных аберраций в гепатоцитах, в то время как удаление щитовидной железы делает невозможным появление антимутагенного эффекта у облученных животных. В работе [34] также представлены данные по изучению влияния микроволн нетепловых интенсивностей на генетический аппарат белых крыс. Было отмечено увеличение количества структурных аберраций в клетках костного мозга крыс.

В [65] проведена оценка чувствительности ДНК и стресс-белков в крови у самцов Wistar к воздействию электромагнитного излучения частотой 900 МГц, при разном времени экспозиции 15, 30 и 60 мин. Были получены результаты, которые показали, что после воздействия в течение 15 и 30 мин происходит значительное увеличение повреждения ДНК лейкоцитов, тогда как после 60 мин уровень повреждения незначителен. Уровень содержания БТШ70 значительно увеличился у животных всех трех групп. Возрастание содержания БТШ70 может быть проявлением защитной реакции организма при повреждении ДНК. Таким образом, экспозиция в течение даже незначительного времени может приводить к существенным изменениям на уровне ДНК, которые, в свою очередь, служат причиной различных заболеваний, в том числе онкологических [18]. Об этом свидетельствуют исследования [3, 66], в которых показана связь между воздействием микроволнового излучения и возрастанием количества заболевших лейкемией и опухолями головного мозга. Имеется также ряд данных, указывающих на генетические изменения, вызванные микроволновым излучением [67,68]. В данных по изучению влияния микроволн нетепловых интенсивностей на генетический аппарат беспородных крыс было отмечено увеличение количества структурных аберраций в клетках костного мозга [49].

Напротив, авторы [69] показали отсутствие статистически значимых различий по количеству белков теплового шока и повреждениям лимфоцитов и моноцитов при воздействии полем 900 МГц на человека (0,4, 2,0 и 3,6 Вт/кг; 20 мин, 1 час и 4 часа). Это может свидетельствовать, о том что при данной мощности и времени экспозиции для человека мобильный телефон не является стресс-фактором для лимфоцитов и моноцитов здорового человека.

Однако авторами [20, 22] было показано, что при воздействии на частоте работы сотового телефона (формат GSM, 900МГц) в течение 30 минут у человека происходит локальное, непродолжительное подавление метаболизма глюкозы в мозге. Особенно сильно это наблюдается на стыке височно-теменной и передней височной долей правого полушария. Имеются также данные о том, что воздействие ЭМИ при частоте 900 МГц приводит к увеличению массы и содержания глюкозы в крови самок хомяка [70].

Под действием ЭМИ СВЧ-диапазона в головном мозге происходит уменьшение количества клеток Пуркинье. Данный эксперимент проводили на самках крыс, которые подвергались облучению при частоте 900 МГц и удельном коэффициенте поглощения 2 Вт/кг. Полученные в эксперименте данные показали значительное расхождение между контрольной и экспериментальной группами [71].

Было выявлено, что эффекты от облучения обнаженного спинного мозга кошек ЭМИ СВЧ диапазона низкой интенсивности имеют временный характер.

СВЧ – облучение оказывает влияние на функциональное состояние нервной системы, а возрастание времени воздействия ведет к изменению состояния морфологических субъединиц. После локального влияния волн СВЧ на мозг в течение 30 мин наиболее заметным эффектом является разбухание сомы (тела) нейронов и, как следствие, достоверное уменьшение

– ядерноцитоплазматического отношения, что приводит к снижению эффективности работы нейронов спинного мозга [72].

Для исследования эффектов воздействия на организм ЭМИ с частотой 900МГц на уровне клеточных мембран определяли функциональные параметры мембран эритроцитов, выделенных из крови животных в различные сроки после облучения. Однократное продолжительное воздействие на крыс ЭМИ с частотой 900МГц способствовало появлению сдвигов в активности Са2+-зависимых К+каналов и гиперполяризации мембран эритроцитов [9].

Рассмотрено влияние ЭМИ СВЧ-диапазона не только на организм в целом, но и на клетки в культуре. Изучено длительное воздействие низкоинтенсивных ЭМИ на продукцию фактора некроза опухоли и интерлейкина-3 перитонеальными макрофагами и Т-клетками у мышей после двукратной иммунизации аффинноочищенной карбоангидразой. На фоне высокого титра продукции антител обнаружено значительное увеличение образования фактора некроза опухоли в перитонеальных макрофагах и в Т-лимфоцитах селезенки иммунизированных мышей, причем гораздо больший эффект наблюдали у иммунизированных животных, облученных ЭМИ СВЧ. Выявлена тенденция к возрастанию секреции интерлейкина-3 у необлученных и облученных иммунизированных животных, причем у последних – в большей степени [73].

При длительном (90 дней) воздействии сотового телефона (модель Nokia 3110, частота 900 МГц) на крыс Wistar в сыворотке крови значительно повышается активность аланинаминотрансферазы, а также концентрация калия по сравнению с животными контрольной группы. При этом изменения активности аспартатаминотрансферазы, г-глутамилтранспептидазы и лактатдегидрогеназы, концентрации кальция и хлора в сыворотке крови облученных животных не происходит. Авторы также показывают, что в условиях эксперимента происходит увеличение концентрации малатдегидрогеназы в тканях мозга и печени у облученных животных.

Приводятся данные о том, что длительное воздействие ЭМП вызывает нарушения поведения, повышение аппетита и увеличение массы тела животных [74].

В ряде работ [1, 10, 19, 21, 46, 75–79] авторы наблюдали увеличение продукции свободных радикалов и снижение активностей COД, каталазы и глутатионпероксидазы в тканях мозга, печени, сердца, легких и крови как после длительного (до 6 месяцев), так и кратковременного (10 дней) воздействия ЭМП сотового телефона.

Защитными свойствами против свободно-радикального окисления в тканях, индуцированного ЭМП СВЧ-диапазона, могут обладать мелатонин [46], витамины Е и С [75, 78], витамины D, A [76].

Представленные в работе [14] данные повторных совместных российскофранцузских исследований подтвердили, что воздействие ЭМИ СВЧ-диапазона, с ППЭ в пределах 50–500 мкВт/см2 приводит к изменению структуры белков, их полимеризации, усилению процессов белкового распада, аутоиммунных процессов, приводя к увеличению концентрации аутоантител.

В целом данные проанализированной литературы свидетельствуют о том, что ЭМП СВЧ-диапазона является чаще всего стресс-фактором, в том числе и для клетки, вызывая каскад неспецифических ответных реакций. Информация о том, что ЭМП низкой интенсивности способны влиять на протекание биохимических процессов, свидетельствует о том, что клетка способна «ощущать»

потенциальную опасность при изменении внешних условий еще задолго до повышения температуры, вызванного поглощением энергии излучения.

Таким образом, ключевыми параметрами при оценке эффектов, вызываемых ЭМП, являются доза, частота излучения и время экспозиции. При этом необходимо оценивать распределение ЭПМ внутри биологической мишени, моделировать механизмы взаимодействия ЭМИ и биологических объектов, прогнозировать физиологические эффекты, индуцируемые ЭМП низкой интенсивности в биологической системе при помощи выявленных механизмов.

Исходя из этого можно судить о вреде или о защитном действии ЭМИ СВЧ на биологические системы, в том числе и человека. При этом возможно дальнейшее применение результатов экспериментальных работ в терапии ряда заболеваний либо коррекции состояний, вызванных воздействием ЭМП [1, 76]. Возможен еще один вид практического применения результатов экспериментальной работы – пересмотр нормативных актов, касающихся электромагнитной безопасности.

1.5. Механизмы действия электромагнитного поля сверхвысокочастотного диапазона на клетки Биологические мембраны как основные структурные компоненты клетки используются во многих концепциях описания механизмов действия ЭМП.

Основная часть работ связывает выраженные эффекты на клеточном уровне с тепловыми последствиями влияния ЭМП. В последнее время биологические эффекты действия ЭМИ СВЧ-диапазона стали рассматривать с позиции проницаемости плазматических мембран с последующим изменением транспорта молекул.

Одной из гипотез, объясняющих механизмы влияния электромагнитных волн на биологические объекты, является гипотеза о резонансном характере такого влияния. При воздействии ЭМИ на мембрану клетки в ней возникают акустические колебания с той же частотой. Это так называемый временной резонанс – возникает при равенстве частот собственных колебаний системы и вынуждающей силы [80–82].

Клеточная мембрана представляет собой двойной слой молекул класса фосфолипидов с включенными в него молекулами белков, выполняющие функции усилителей прочности мембраны, переносчиков, каналов, катализаторов, рецепторов. С точки зрения электростатики клеточная мембрана представляет собой конденсатор с положительно заряженной обкладкой снаружи и отрицательно – изнутри клетки. Разность потенциалов между обкладками этого «конденсатора» достаточно велика (порядка 0,1 В), а толщина мембраны мала (порядка 10-8 м). Поэтому напряженность электрического поля внутри бислоя должна быть очень высокой (порядка 107 В/м). Если на клетку воздействовать ЭМИ соответствующей частоты, то по мембране побежит акустическая волна (продольная). При этом потенциальная энергия электрического поля мембраны преобразуется в кинетическую энергию движения ее компонентов и наоборот.

Таким образом, электромагнитная энергия преобразуется в энергию акустоэлектрических волн.

В результате резонанса амплитуда акустических колебаний возрастает, а, следовательно, возрастает транспорт ионов через мембрану и всех сопутствующих процессов [80].

В работе [83] рассмотрен другой механизм возникновения колебаний в мембране. Поляризованные молекулы липидов в электрическом поле смещаются в направлении вектора действия поля. В результате периодически меняется диэлектрическая проницаемость в областях мембраны. Изменение диэлектрической проницаемости приводит к изменению энергии электростатического поля. Энергия электростатического поля «перекачивается» в кинетическую энергию смещений липидных молекул и обратно. Эти новые колебания – поляризационные колебания – обладают той замечательной особенностью, что толщина липидного слоя практически не меняется, а поверхность цитоплазмы неподвижна, в связи с последним, поляризационные колебания в мембране клетки не приводят к диссипации энергии. В связи с этим на много порядков возрастает интеграл перекрытия этих колебаний с электромагнитной волной в резонансе.

В пользу того, что именно поляризационные колебания лежат в основе значительной части биологических эффектов, обнаруженных при взаимодействии слабого электромагнитного поля с биологическими объектами, может служить теоретическая работа [83] о фазовых переходах в мембранах и возникновении пор при понижении мембранного потенциала.

Таким образом, при определении механизмов влияния ЭМИ СВЧ-диапазона как на теоретических, так и на экспериментальных моделях необходимо учитывать не только дозиметрические характеристики, но и «понижать» при необходимости уровень рассмотрения эффектов с целого организма до органов, тканей, клеток, субклеточных и молекулярных структур. Такая попытка обобщения подходов к исследованию приведена на рисунке 2.

Рисунок 2 – Схематическое представление мультимасштабной методологи для моделирования взаимодействия внешних электромагнитных полей и биологических систем [Цит. по 84 C.2032] Глава 2. Материалы и методы

–  –  –

Исследование проводили на белых лабораторных мышах-самцах аутбредной популяции ICR массой 25–27 г и крысах-самцах популяции Wistar массой 200–250 г, полученных в питомнике Федерального государственного бюджетного учреждения науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Всего в работе использовано 520 животных. Исследования проводили в соответствии с Международными правилами с соблюдением биоэтических норм работы с лабораторными животными [85].

2.1.2. Характеристика штамма асцитной карциномы Эрлиха

В качестве модели быстропролиферирующей клеточной популяции в работе использовали асцитную карциному Эрлиха (АКЭ). Кривая роста АКЭ является типичной для перевиваемых опухолей и включает три участка, отражающих фазы развития популяции опухолевых клеток в организме опухоленосителя. Первую фазу сутки) можно определить как латентный период, который (1–5 характеризуется адаптацией клеток АКЭ к организму после внутрибрюшинной трансплантации. Далее наступает фаза экспоненциального роста с активной пролиферацией клеток (7–9 сутки). Завершающей стадией опухолевого процесса является стадия «плато» (11–15 сутки), в течение которой количество клеток АКЭ изменяется незначительно вследствие выраженного ухудшения опухолевого микроокружения и состояния организма опухоленосителя в целом. При этом прививаемость опухоли при классическом способе прививки АКЭ, использованном в настоящей работе, составляет А средняя 100 %.

продолжительность жизни животных с АКЭ составляет 15 суток [86–92].

Строение плазматической мембраны клеток АКЭ имеет сходное строение с мембранами нормальных клеток животных [93]. В то же время известно, что в отличие от клеток нормальных тканей, мембраны клеток АКЭ содержат все ферменты гликолиза с высоким сродством к глюкозе, чем обусловлено повышенное потребление глюкозы опухолью [94, 95].

При этом клетки АКЭ содержат функционирующие митохондрии, которые делают их способными усваивать кислород при его наличии в клеточном микроокружении [96–104]. Однако потребление кислорода клетками АКЭ при его наличии не приводит к снижению уровня гликолитического получения энергии, что является характерным для большинства из известных опухолей [105].

Использование опухолевыми клетками энергетических и пластических ресурсов организма опухоленосителя приводит к их недостаточности для нормального функционирования метаболических путей в клетках нормальных тканей больного организма, в результате чего может наблюдаться развитие компенсаторных реакций, направленных на поддержание гомеостаза организма опухоленосителя [89, 105].

Таким образом, развитие опухоли является внутренним неблагоприятным фактором для организма, в котором включаются механизмы ответа на стрессвоздействие.

Для перевивки использовали опухоль, полученную у Перевивка.

животных-доноров на 9 сутки развития АКЭ. Суспензию опухолевых клеток с концентрацией 15х106 клеток/мл вводили в брюшную полость мыши в объеме 0,2 мл.

2.2. Источники электромагнитного излучения СВЧ-диапазона, используемые в эксперименте Для выполнения работы в качестве источников электромагнитного излучения использовали сотовые телефоны марок Nokia 6300, Sony Ericsson W610i (900 МГц, ППЭ 7–9 мкВт/см2) и установку для облучения лабораторных животных электромагнитным полем СВЧ-диапазона, разработанную совместно с сотрудниками кафедры Радиотехники Института инженерной физики и радиоэлектроники СФУ [106]. Облучение в установке производили ежедневно (1 ГГц, ППЭ 70 мкВт/см2).

Схема установки представлена на рисунке 3.

Рисунок 3 – Структурная схема установки радиофизического воздействия СВЧ излучения на подопытных животных Генератор СВЧ энергии вырабатывает гармонический СВЧ сигнал частотой 1 ГГц и мощностью до 80 мВт. Измерение производили прибором М3–21А, подключаемым через аттенюатор с вносимым затуханием 30 дБ, использование которого необходимо для исключения возможности выхода из строя измерительной термоголовки измерителя мощности. Плотность потока энергии (ППЭ) – 70 мкВт/см2 СВЧ-энергия поступала от генератора Г4-22 через согласующий трансформатор и СВЧ коаксиальный кабель в тройник, где часть энергии ответвлялась для измерения уровня мощности, поступающей на облучаемый объект. Отрезок коаксиального кабеля необходим для осуществления конструктивного перехода от трансформатора к тройнику. Также из конструктивных соображений на выходе тройника установлен второй отрезок коаксиального кабеля, который реализует передачу СВЧ-энергии от тройника к антенне, облучающей исследуемый объект. Антенна, облучающая исследуемый объект, представляет собой разомкнутый на конце штыревой резонатор, выполненный из 1,5 мм медной проволоки. СВЧ-энергия подавалась на штыревую антенну через коаксиальный корпусной разъем, установленный на стенке металлической защитной камеры. Длина антенны выбрана равной четверти длины электромагнитной волны в свободном пространстве. Расстояния от антенны до стенок защитной камеры составляют не менее 10 см.

Защитная камера представляет собой металлический ящик со съемной крышкой и вентиляционными щелями для обеспечения подачи воздуха животному, находящемуся в эксперименте. Внутри защитной камеры под антенной на расстоянии около 1 см расположена метаболическая камера (плексигласовый бокс с присоединённым перистальтическим насосом, подающим воздух в камеру со скоростью 100 мл/мин, и отводом для забора проб), т.е., все генерируемое электромагнитное поле концентрируется в объекте, мало распространяясь в окружающее пространство.

Наличие измерителя мощности М3–21А в составе представленной установки позволило осуществлять постоянный контроль уровня мощности в канале передачи СВЧ-энергии на облучаемый объект, а также регулировать уровень мощности в канале до желаемого значения. Уровень мощности измерялся и устанавливался ежедневно до начала эксперимента.

–  –  –

Измерение относительной микровязкости мембраны клеток оценивали по движению флуоресцентного зонда – пирена, включенного в мембрану. Вязкость характеризует трение, возникающее между соседними слоями жидкости, которые движутся с разными скоростями. Возбужденная молекула пирена, сталкиваясь с идентичной невозбужденной молекулой, образует комплекс – эксимер (димер).

Пирен концентрируется в гидрофобных компартментах мембраны, располагаясь между жирнокислотными цепями липидов, его эксимеризация пропорциональна подвижности молекул зонда в бислое. Поэтому при прочих равных условиях и неизменной концентрации пирена коэффициент эксимеризации Кэ пропорционален текучести мембраны. При уменьшении микровязкости мембранного бислоя подвижность жирнокислотных цепей в середине бислоя возрастает, увеличивается и вероятность встречи молекул пирена. Поскольку при образовании эксимера на перенос заряда с одной молекулы пирена на другую тратится часть энергии, то эксимер флуоресцирует в более длинноволновой области (Стоксов сдвиг). Таким образом, образование димера можно определить по появлению новой полосы флуоресценции, в области длин волн, больших, чем те, при которых наблюдается обычный спектр флуоресценции зонда [107, 108].

Ход определения. В стаканчик помещали 2,5 мл раствора пирена в конечной концентрации 3 мкМ и 20 мкл суспензии клеток АКЭ. Смесь инкубировали в течение 1 мин на магнитной мешалке при комнатной температуре, затем 2 мл полученной суспензии помещали в кювету. Снимали спектры флуоресценции на спектрофлуориметре Aminсo Bowman Series 2 (Thermo Spectronic, USA). Для каждого образца определяли микровязкость липидного бислоя мембран клеток (длина волны возбуждения возб= 334 нм) и микровязкость зон белок-липидных контактов (длина волны возбуждения возб= 286 нм).

Коэффициент эксимеризации пирена равен отношению интенсивности флюоресценции эксимеров (длина волны испускания эксимеров 470 нм) и мономеров (длина волны испускания мономеров 395 нм).

Кэ=Jэ/Jм, (1) где Jэ – интенсивности флуоресценции эксимеров; Jм – интенсивности флуоресценции мономеров.

Значение микровязкости мембран опухолевых представлено в работе в относительных единицах.

2.3.2. Метод перфузии изолированной печени крыс

Изолированный перфузируемый орган является важной и информативной моделью для исследования биохимических и физиологических параметров интактного органа. Данный метод позволяет исследовать функциональную активность органа, не нарушая его физиологического строения, сохраняя расположение сосудов и тканей внутри органа, функции, выполняемые им в организме. При этом влияние на исследуемый орган со стороны остальных систем организма может быть частично или полностью исключено.

В первую очередь методы перфузии можно разделить на рециркуляционные и нерециркуляционные. Так, в первом варианте перфузионная жидкость проходит через орган и собирается в специальную емкость. Отбор проб осуществляется как до попадания жидкости в орган, так и после, в то время как при рециркуляционной перфузии кровезаменитель проходит через орган не один раз, но отбор проб также происходит из входного и выходного кровотока. Для проведения рециркуляционной перфузии используются специальные аппараты жизнеобеспечения органа такие как «Гомеостат» или «Система восстановления органов» [109–113]. А для нерециркуляционной перфузии чаще всего собирают систему из пузырькового оксигенатора, перистальтического насоса и термостата. В такой системе оксигенатор выполняет функцию легких, перистальтический насос – сердца, а термостат обеспечивает поддержание постоянной температуры протекающей жидкости – перфузата.

При поддержании жизнедеятельности органа в зависимости от целей исследования используются различные культуральные среды [114]. В качестве перфузата в нашей работе использовали раствор Кребса-Ханселейта с добавлением глюкозы (10 ммоль) и лактата (6 ммоль).

Исследование метаболизма печени проводили на установке для проточной перфузии, разработанной в МНЦИЭСО при Президиуме КНЦ СО РАН (рисунок 4).

–  –  –

Рисунок 4 – Схема установки для перфузии изолированного органа Операцию выделения органа проводили под общим тиопентал-натриевым наркозом по схеме [110]. Стабилизацию гемостаза осуществляли внутривенным введением в бедренную вену гепарина (1000 ед./кг массы). Печень после канюлирования воротной вены инфузировали (под давлением 5–7 см вод. ст.) охлажденным до +10°С раствором Кребса–Хенселейта.

Перфузию проводили с использованием установки с разомкнутым контуром кровообращения. Чтобы условия приближались к естественным, перфузию печени проводили при пульсирующем кровотоке в печеночной артерии, а в воротной вене – при ламинарном. Орган находился в установке 120 мин.

Давление в воротной вене в ходе эксперимента определяли прямым манометрическим измерением [115]. Единицы измерения – сантиметры водного столба. В работе данные представлены в виде относительных безразмерных единиц – процент от исходной величины.

–  –  –

У животных, находящихся в метаболической камере, проводили забор проб газовой смеси в объеме 20 мл через 1, 15, 30, 45 мин после помещения в камеру.

Содержание кислорода и углекислого газа в газовой смеси определяли потенциометрическим методом с использованием анализатора газов и метаболитов ABL 800 FLEX (Radiometer, Дания).

Удельную скорость потребления кислорода (VO ) и углекислого газа (VCO )

–  –  –

метаболической камере, ммоль/мин/г; VCO – удельная скорость выделения углекислого газа животным, находящимся в метаболической камере, ммоль/мин/г.

2.4.2. Определение содержания кислорода, углекислого газа, глюкозы и лактата в периферической крови животных У животных, находящихся в эксперименте забирали кровь в объеме 195 мкл.

Содержание кислорода, углекислого газа, глюкозы и лактата в образце определяли потенциометрическим методом с использованием анализатора газов и метаболитов ABL 800 FLEX (Radiometer, Дания).

–  –  –

где Епр – оптическая плотность пробы;

Екал – оптическая плотность калибратора;

3,3 – концентрация лактата в калибраторе в моль/л или мг/100мл соответственно.

Данные выражали в виде относительных безразмерных единиц – процент от исходной величины.

–  –  –

Экстрагирование ферментов после размораживания суспензии клеток асцитной карциномы Эрлиха и гепатоцитов, полученных от мышейопухоленосителей, осуществляли по методике Одновременно, в [117].

исследуемых образцах определяли количество белка по методу Бредфорд [118].

Определение активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ проводили по методикам [119, 120] с использованием сопряженной биолюминесцентной системы, содержащей люциферазу и НАД(Ф)H оксидоредуктазу, которая восстанавливает ФМН до ФМНH2, который, в свою очередь, требуется для люциферазной реакции. Ферментативная система НАД(Ф)Н:ФМНоксидоредуктаза-люцифераза изготовлена из очищенных методами ионообменной хроматографии и гель-фильтрации люциферазы из Photobacterium leiognathi и оксидоредуктазы из Vibrio fischeri в Институте биофизики СО РАН г. Красноярска.

Проводили определение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы лактатдегидрогеназы НАД- и НАДФ-зависимых (Г6ФДГ), (ЛДГ), малатдегидрогеназ НАДФМДГ), НАД- и НАДФ-зависимых (НАДМДГ, глутаматдегидрогеназ (НАДГДГ, НАДФГДГ), глутатионредуктазы (ГР), НАДзависимой изоцитратдегидрогеназы (НАДИЦДГ). Активность ЛДГ, НАДМДГ, НАДФМДГ, НАДГДГ и НАДФГДГ определяли как для прямых, так и для обратных реакций (соответственно, Обр.ЛДГ, Обр.НАДМДГ, Обр.НАДГДГ, Обр.НАДФГДГ).

Ход определения. К 150 мкл инкубационной смеси, содержащей соответствующий субстрат и кофактор, вносили 50 мкл суспензии исследуемых клеток. Конкретные значения концентраций субстратов и кофакторов, а также рН среды для определяемых ферментов представлены в таблице 2. Для определения активности НАДИЦДГ в среду дополнительно добавляли 1,3 мМ АДФ, для определения активности Обр.НАДГДГ и Обр.НАДФГДГ – 5,0 мМ NH4Cl, для определения активности ГР – 0,5 мМ ЭДТА.

Пробы инкубировали при 37оС в течение 30 мин (для ферментативных реакций с восстановлением НАД(Ф)+) или 5 мин (для реакций с окислением НАД(Ф)Н). К мкл инкубационной смеси добавляли мкл флавинмононуклеотида (ФМН) в концентрации 1,510-5 М, 50 мкл 0,0005% миристинового альдегида и мкл ферментативной системы НАД(Ф)Н:ФМНоксидоредуктаза-люцифераза биолюминесцентной (реактивы системы разводили в 0,1 М К+, Na+-фосфатном буфере, рН 7,0). После смешивания биолюминесцентных реактивов и инкубационной пробы производили измерение свечения биолюминометром «БЛМ–8802»

(сконструированном в СКТБ «Наука», г. Красноярск).

–  –  –

Примечание: среды с рН 9,0 и 9,8 готовили на Трис-HCl буфере; с рН 7,0 и 7,4 – на К+,Na+-фосфатном буфере.

Для каждого фермента определяли показатели, условно названные «субстратный фон ферментов», поскольку в клетках имеется определенное количество субстратов для течения различных метаболических реакций, в том числе и катализируемых исследуемыми ферментами. Определение производили в тех же условиях, но в инкубационную смесь вместо соответствующего субстрата добавляли буфер. Для получения абсолютных значений активности, строили калибровочный график зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации НАД(Ф)Н. Для этого 200 мкл стандартного раствора НАД(Ф)Н в диапазоне 10-9–10-4 М вносили в кювету, содержащую биолюминесцентные реактивы и измеряли интенсивность биолюминесцентной реакции. В связи с широким диапазоном рН буферов, используемых для определения дегидрогеназной активности, а также рН-зависимостью биолюминесценции ферментативной системы, калибровочные графики строились отдельно для каждого буфера [119]. На рисунке 5 представлен пример подобной зависимости.

Рисунок Интенсивность биолюминесценции НАД(Ф)Н:ФМН 5 – оксидоредуктазы-люциферазы в зависимости от концентрации НАД(Ф)Н и рН буфера

Активность НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ рассчитывали по формуле:

А = ([C]V106) / t, (6) где [C] – разница концентраций НАД(Ф)Н в пробах «фермент» и «фон фермента», V – объем пробы в миллилитрах, t – время инкубации.

Активность выражали в ферментативных единицах, отнесенных к 1 мг общего белка в экстракте, где 1 Е=1 мкмоль/мин [118, 119].

2.4.6. Определение уровня генерации активных форм кислорода методом хемилюминесцентного анализа По изменению интенсивности спонтанной хемилюминесценции биологических тканей, жидкостей и клеточных суспензий можно судить о быстропротекающих сдвигах равновесия про- и антиоксидантной систем (рисунок 6), оценивать их направление без учета поведения компонентов равновесия и скорость процессов образования активных форм кислорода. Метод высоко чувствителен, неинвазивен, применяется в диагностике ряда заболеваний[122– 127].

–  –  –

Рисунок 6 – Фазы развития сверхслабого свечения в гомогенатах (имп./с):

I – элюирование; II – накопление окисленного продукта (ХО2); III – расход (ХО2), сопровождающийся свечением; IV – остаточное свечение [123] В качестве «люминесцентных зондов» использовали люминол и люцигенин, легко окисляемые свободно-радикальными формами кислорода с 3% квантовым выходом люминесценции в диапазоне 300-600 нм при максимуме излучения на длине волны 425 нм. Они могут либо участвовать в реакциях, образуя электронвозбужденные продукты активаторы или (химические хемилюминесцентные зонды), либо увеличивать квантовый выход эмиссии фотонов в результате переноса энергии электронного возбуждения на активатор (физические активаторы или сенсибилизаторы хемилюминесценции) [127].

Люцигенин избирательно реагирует на образование супероксида (О2-), тогда как люминол дает свечение под действием многих окислителей (ОН-, Н2О2 др.).

Для получения гомогената печени выделяли орган из организма животного и помещали в гомогенизатор. Гомогенизированную массу фильтровали и отмывали раствором Хенкса. Подсчет числа клеток ткани печени проводили в камере Горяева.

Ход определения. Для проведения хемилюминесцентного анализа в кювету набирали 100 мкл суспензии исследуемых клеток (6х106кл./мл), 200 мкл 2,2х10-4 М люминола (Sigma, USA) или люцигенина (Sigma–Aldrich, Switzelend) в растворе Хенкса, 50 мкл суспензии опсонизированных белками сыворотки крови человека частиц монодисперсного латекса (ВНИИСК, С-Петербург) размером 2,3 мкм в концентрации 5х108 частиц/мл для активирования фагоцитоза in vitro.

Регистрацию активных форм кислорода (АФК) in vitro при антигенной активации и без нее проводили в течение 90 мин при температуре 37° С на аппаратурно-программном комплексе «Хемилюминометр CL–3604–ПЭВМ», предназначенном для измерения сверхслабых свечений биологической и физикохимической природы.

Оценку продукции АФК проводили по амплитуде максимальной активности хемилюминесцентной реакции (Imax, имп./с).

–  –  –

2.5.1. Определение жизнеспособности клеток опухоли Жизнеспособность клеток АКЭ определяли по окраске трипановым синим.

Трипановый синий – бензидиновый краситель, водный раствор которого имеет синий цвет; малотоксичен; применяется для витальной окраски препаратов.

Живые клетки непроницаемы для красителя, а мембраны погибших клеток проницаемы, вследствие чего клетки окрашиваются.

Использовали 1% раствор трипанового синего, приготовленный на 0,9% растворе хлорида натрия. Подсчет производили в 100 больших квадратах в камере Горяева при малом увеличении микроскопа.

2.5.2. Приготовление и окраска препаратов

На обезжиренные предметные стекла наносили каплю исследуемой суспензии клеток и делали мазок. Подсохшие на воздухе мазки асцитной карциномы Эрлиха помещали в краску-фиксатор Май-Грюнвальда на 3 мин, далее ополаскивали проточной водой и высушивали. Дальнейшую окраску производили красителем Романовского-Гимза (20 мин), после чего мазки промывали проточной водой, высушивали и микроскопировали (ок.х10, об.х90) с использованием иммерсионного масла. В результате взаимодействия с красителем клетки приобретают ярко выраженную специфическую окраску, что позволяет произвести подсчет и дифференцировку клеток [128].

На приготовленных мазках крови подсчитывали диаметры 1000 эритроцитов. На основании полученных данных строили кривые Прайс-Джонса, отражающие распределение эритроцитов по диаметру.

На приготовленных мазках АКЭ подсчитывали количество клеток, находящихся в состоянии блеббинга, их можно определить по активности цитоплазмы [129] (на мембране появляются выпячивания в виде лепестков цветка

– «ромашка») (рисунок 7). Всего насчитывали 200 опухолевых клеток, выделяя клетки в состоянии блеббинга, попавшие в поле зрения.

Рисунок 7 – Клетки опухоли, стрелкой указаны клетки в состоянии блеббинга

–  –  –

Статистическую обработку результатов производили с применением критерия Стьюдента. Различия между выборками считали достоверным при уровне значимости меньше 0,05.

Для доказательства адекватности применения критерия Стьюдента проводили проверку нормальности распределения с определением выборочных коэффициентов асимметрии и эксцесса.

Гипотезу о том, что генеральная совокупность, из которой извлечена выборка, распределена по нормальному закону, проверяли с использованием 2, критерия согласия Пирсона сравнивая теоретическое нормальное распределение с числовыми характеристиками данной совокупности и распределение, полученное в эксперименте [130].

Глава 3. Результаты исследования и обсуждение

3.1. Реакция организма здорового животного и животного с асцитной карциномой Эрлиха на действие ЭМИ СВЧ-диапазона Для понимания механизмов отклика живых объектов на действие любого абиотического фактора необходим системный подход. В ответ на действие фактора внешней среды в масштабах всего организма происходят изменения, которые начинаются с молекулярного уровня (перераспределение заряда на мембране, перераспределение потоков веществ, изменения структуры макромолекул и др.). Эти реакции приводят к изменениям гомеостаза всего организма и в конечном итоге к формированию нового устойчивого состояния

– реконструированного гомеостаза [131].

Для оценки влияния ЭМИ СВЧ-диапазона на организм здорового животного и животного с асцитной карциномой Эрлиха in vivo было предпринято следующее исследование. Схема эксперимента представлена на рисунке 8.

–  –  –

Рисунок 8 – Схема эксперимента 1 – генератор СВЧ энергии (Г4-22); 2 – измеритель мощности М3–21А; 3 – антенна; 4 – защитная камера; 5 – метаболическая камера; 6 – забор проб и измерение образцов; 7 – перистальтический насос.

–  –  –

2,00 2,00 1,00 1,00

–  –  –

3,00 3,00 2,00 2,00 1,00 1,00

–  –  –

3,00 3,00 2,00 2,00 1,00 1,00

–  –  –

2,00 2,00 1,00 1,00

–  –  –

3,00 3,00 2,00 2,00 1,00 1,00

–  –  –

4,00 3,00 3,00 2,00 2,00 1,00 1,00

–  –  –

Следует отметить, что животные второй группы не только потребляли большее количество кислорода в первый час воздействия ЭМИ СВЧ, но и выделяли большее количество углекислого газа. С увеличением суммарного времени облучения (более 6 часов) выделение углекислого газа остается повышенным у второй группы животных.

Из рисунков 10а и 10е видно, что у животных-опухоленосителей, которые не подвергались воздействию ЭМИ СВЧ, скорость выделения СО2 снижена по сравнению с остальными группами животных. Животные-опухоленосители, находящиеся под действием ЭМИ СВЧ-диапазона в течение первого часа облучения (2 сутки развития опухоли) выдыхали углекислого газа больше, чем животные с АКЭ, не подвергавшиеся воздействию. По мере роста опухоли и увеличения суммарного времени облучения выделение СО2 происходит так же, как и в остальных группах, либо чуть повышено по сравнению с животными группы 3.

Для определения особенностей обмена веществ в организме животного важное значение имеет показатель дыхательного коэффициента (отношение объема выделяемого из организма углекислого газа к объему поглощаемого за то же время кислорода) [116]. Поскольку в организме все питательные вещества подвергаются окислению, определяя величину дыхательного коэффициента, можно судить о преимущественном использовании в качестве субстратов окисления жиров, белков или углеводов. Известно, что при окислении в организме углеводов и полном доступе кислорода дыхательный коэффициент будет равен 1, жиров – 0,7, белков – 0,8. Показатели дыхательного коэффициента для исследуемых групп представлены в таблицах 3–6.

Из данных, представленных в таблицах, видно, что наиболее стабильны значения показатели дыхательного коэффициента в группе 2: он держится в пределах 0,8 на протяжении всего периода исследования.

Таблица 3.

Изменение дыхательного коэффициента у животных группы 1 в течение эксперимента Время Время забора проб, мин облучения, сутки 1 0,8 ±0,04 0,8 ±0,03 0,8 ±0,04 0,8 ±0,03 0,7 ±0,05 2 0,7 ±0,03 0,7 ±0,01 0,7 ±0,01 0,7 ±0,01 0,7 ±0,01 3 0,8 ±0,04 0,9 ±0,01 0,9 ±0,01 0,8 ±0,01 0,8 ±0,02 4 0,7 ±0,01 0,8 ±0,01 0,7 ±0,01 0,7 ±0,02 0,8 ±0,05 5 0,8 ±0,02 0,9 ±0,00 0,9 ±0,01 0,9 ±0,02 0,9 ±0,01 6 0,9 ±0,01 0,8 ±0,03 0,8 ±0,02 0,8 ±0,01 0,8 ±0,04 7 0,7 ±0,01 0,8 ±0,01 0,8 ±0,03 0,8 ±0,01 0,7 ±0,01 8 0,8 ±0,05 0,8 ±0,02 0,8 ±0,01 0,8 ±0,03 0,8 ±0,01 9 0,7 ±0,03 0,8 ±0,01 0,7 ±0,05 0,7 ±0,04 0,8 ±0,01 10 0,7 ±0,04 0,7 ±0,05 0,8 ±0,01 0,8 ±0,01 0,8 ±0,01 11 0,7 ±0,03 0,8 ±0,01 0,8 ±0,03 0,7 ±0,05 0,8 ±0,01

–  –  –

У животных группы чаще встречается значение дыхательного коэффициента равное 0,7. У животных-опухоленосителей, которые подвергались воздействию ЭМИ СВЧ-диапазона, вероятно, с развитием опухоли снижается запас углеводов в организме и усиливается диссимиляция жиров, поэтому дыхательный коэффициент составляет около 0,7. В контрольной группе наблюдали самый большой разброс значений дыхательного коэффициента по сравнению с экспериментальными группами животных. Вероятно, выравнивание значений дыхательного коэффициента в группах, подвергшихся воздействию ЭМИ СВЧ, является ответной реакцией на стресс, вызванный влиянием фактора внешней среды – электромагнитного поля.

Для адекватного энергообеспечения процессов жизнедеятельности организма необходимо, чтобы для каждой его структуры эффективность биологического окисления соответствовала уровню функциональной активности.

Для оценки содержания углекислого газа, кислорода, глюкозы и лактата в крови проводили измерение этих параметров в образцах периферической крови испытуемых животных.

Из рисунка 11 видно, что происходит постепенное повышение содержания углекислого газа в крови до 10 ч суммарного воздействия ЭМИ СВЧ. К 10 часам облучения содержание углекислого газа в крови достоверно не отличается от контроля. При воздействии ЭМИ СВЧ-диапазона на здоровых животных после 12 часов облучения содержание углекислого газа в крови резко снижается, а у опухоленосителей продолжает увеличиваться относительно контрольных значений.

Содержание кислорода (рисунок 12) в периферической крови животныхопухоленосителей было выше контрольных значений на протяжении всего периода исследования. Однако при облучении свыше 8 ч содержание кислорода в крови падает, к 12 ч выходя на уровень контроля. После 8 и 10 ч облучения здоровых животных (группа 2) содержание кислорода в крови падает и восстанавливается до исходного уровня только после 12 ч влияния ЭМИ СВЧдиапазона.

–  –  –

Рисунок 12 – Содержание кислорода в крови здоровых животных (а) и в крови животных-опухоленосителей (б) после воздействия ЭМИ СВЧ-диапазона По оси ординат – концентрация кислорода в крови (ммоль/л), по оси абсцисс – суммарное время облучения животных ЭМИ СВЧ диапазона.

Как видно из рисунков, у здоровых животных, подвергшихся воздействию СВЧ излучения, происходит одновременное снижение содержания глюкозы и лактата в крови относительно контрольных значений после 6 и 12 ч суммарного воздействия. Пониженное содержание глюкозы и лактата в крови относительно контроля может свидетельствовать об уменьшении доли гликолиза в энергетическом обмене. Как раз на этих временных интервалах содержание кислорода в периферической крови достаточно высоко. Вероятно, поэтому и происходит переключение метаболических потоков в сторону включения белков в процесс окисления и получения энергии организмом альтернативным путем, о чем и свидетельствует значение дыхательного коэффициента.

После воздействия электромагнитного поля в венозной крови животных измеряли содержание глюкозы и лактата (рис.13–14).

У животных-опухоленосителей под действием излучения, наоборот, происходит увеличение содержания глюкозы и лактата в крови.

Данные рисунка 14 показывают, что содержание глюкозы в крови животных-опухоленосителей после 8 ч облучения ниже по сравнению с контролем. Вероятно, это связано с реакцией организма на стрессовое влияние как внешнего фактора – электромагнитного поля, так и внутреннего – развития опухоли в организме.

Так же как и содержание глюкозы в периферической крови, содержание лактата в крови экспериментальных животных снижено относительно контроля (рисунок 14). Снижение содержания глюкозы и лактата в периферической крови животных-опухоленосителей может быть связано с развитием опухоли в организме, т.к. известно, что клетки асцитной карциномы Эрлиха обладают мощной гликолитической активностью и их процессы дыхания не в состоянии «подавлять» гликолиз и тем самым уменьшить потребление глюкозы. В организме печень может поставлять глюкозу за счет синтеза, основными субстратами которого служат лактат, глицерин и аминокислоты.

–  –  –

группа1 ммоль/л группа 3 группа 4 t, ч б Рисунок 14 – Содержание глюкозы (а) и лактата (б) в периферической крови животных-опухоленосителей По оси ординат – концентрация метаболитов в крови (ммоль/л), по оси абсцисс – суммарное время облучения животных ЭМИ СВЧ диапазона.

Развитие опухоли в организме меняет биосинтетические и биоэнергетические параметры опухолевых клеток. Считают, что изменение липидного обмена – признак опухолевых клеток, поскольку фосфолипиды являются не только ключевыми структурными компонентами мембран клеток, но и облегчают формирование устойчивой сигнализации для транспорта веществ внутри клетки, пролиферации и миграции, необходимых для осуществления жизнедеятельности опухолевой клетки [100–103]. Снижение содержания глюкозы приводит к тому, что липиды могут включаться в энергетический обмен для выживания опухолевых клеток.

Из рисунка 14 видно, что в крови животных группы 3 (животныхопухоленосителей) к 13 суткам развития опухоли в организме и 12 ч суммарного облучения уровень содержания глюкозы и лактата ниже, чем у животных группы

1. Следует отметить, что при воздействии ЭМИ СВЧ-диапазона динамика содержания глюкозы и лактата в крови на протяжении всего времени эксперимента сходная, и отличается от значений, полученных в группе 1 (у здоровых животных).

Одновременное повышение содержания глюкозы и лактата в периферической крови может свидетельствовать о том, что в организме происходит рассогласование процессов аэробной и анаэробной утилизации глюкозы.

Вероятно, все эти процессы и приводит к включению белков и липидов в энергетический обмен, о чем свидетельствует значение дыхательного коэффициента.

В периферической крови крыс, подвергавшихся воздействию ЭМИ СВЧ– диапазона в установке для облучения в течение 5 суток по 3 часа ежедневно оценивали изменения внешнего диаметра эритроцитов (рисунок 15). На вторыечетвертые сутки (суммарное время воздействия 6-12 ч) после облучения животных в периферической крови наблюдали увеличение среднего диаметра эритроцитов с 7 до 8 мкм (кривая распределения смещена вправо). На пятые сутки средний диаметр эритроцитов возвращается к норме – 7 мкм.

–  –  –

д Рисунок 15 – Кривые Прайс-Джонса для эритроцитов крыс после облучения ЭМИ СВЧ-диапазона а – после 3 часов облучения; б – после 6 часов облучения; в – после 9 часов облучения; г – после 12 часов облучения; д – после 15 часов облучения.

Эти изменения, с одной стороны, могут быть связаны с выбросом на периферию незрелых крупных форм эритроидных предшественниковполихроматофилов, т.н. резервный эритропоэз. Известно, что реакция системы красной крови животных в условиях недостатка кислорода имеет адаптивную направленность, называемую «резервным эритропоэзом», в которой выделяют три типа репаративного эритропоэза [132-135]. При воздействии ЭМИ СВЧдиапазона на организм крыс вероятнее всего наблюдается эритропоэз второго типа, характерный для анемий средней тяжести, при котором периферические нормохромные эритроциты происходят от активно полиферирующих полихроматофильных эритробластов на фоне сниженного содержания кислорода в периферической крови (рисунок 12).

С другой стороны, увеличение размера эритроцитов может являться следствием снижения энергетического статуса клетки, приводящего к увеличению объема клетки [136-137].

Методом хемилюминесцентного анализа определяли изменение генерации активных форм кислорода (АФК) в периферической крови и печени крыс.

Образование свободных радикалов кислорода в биологических системах происходит постоянно и является как прямым результатом функционирования специальных ферментных систем, так и следствием побочного процесса множества окислительно-восстановительных реакций. Значительный интерес в отношении короткоживущих АФК (супероксида, гидроксильного радикала) обусловлен тем, что они обладают очень высокой химической активностью. В обычных условиях, когда скорость образования свободных радикалов относительно невысока, антиоксидантные системы клетки в состоянии нейтрализовать свободные радикалы и не допустить развитие окислительного стресса. В экстремальных условиях уровень продукции АФК клетками может изменяться [121, 124, 138]. Это связано как с нарушениями гомеостаза организма, так и с мобилизацией его резервных возможностей.

Спонтанная продукция АФК клетками периферической крови, регистрируемая в присутствии люцигенина (рисунок 16 а), после ежедневного воздействия электромагнитного поля в течение 1 ч снижена по сравнению как с контрольными значениями, так и с показателями, полученными у животных в группе 3, облучаемых по 3 ч ежедневно. При антигенной активации уровень содержания активных форм кислорода в крови животных, ежедневно подвергавшихся воздействию ЭМИ СВЧ выше, чем в двух других образцах.

Наблюдаемый эффект может свидетельствовать о дополнительных возможностях клеток крови крыс к образованию первичных свободных радикалов после длительного воздействия электромагнитного поля СВЧдиапазона на организм.

–  –  –

б Рисунок 16 – Значения максимума интенсивности хемилюминесцентной реакции в клетках периферической крови крыс, регистрируемые при антигенной активации (а) и без нее (б) в хемилюминесцентной реакции с люцигенином в зависимости от длительности воздействия ЭМИ СВЧ-диапазона (имп./с) Из данных, представленных на рисунке 17, видно, что уровень образования вторичных радикалов клетками крови крыс, облучаемых ежедневно в течение 3 ч (группа 3), выше, чем в других группах как при спонтанной реакции, так и при антигенной активации хемилюминесцентной реакции. Интенсивность свечения в образцах крови крыс, облучавшихся ежедневно в течение 1 ч (группа 2), от контрольных значений достоверно не отличалась.

I, имп./с

–  –  –

Характер изменения продукции первичных свободно-радикальных форм в гомогенате печени под действием электромагнитного поля, регистрируемого в хемилюминесцентной реакции с люцигенином (рисунок 18 а, б) (как в спонтанной, так и активированной in vitro), сходен с развитием процесса в клетках периферической крови крыс.

–  –  –

В гомогенате печени животных группы 2, подвергавшихся ежедневному воздействию ЭМИ СВЧ в течение 1 ч, значение максимума в спонтанной реакции с люцигенином ниже, чем в других группах, тогда как при ежедневном облучении в течение 3ч (группа 3) в гомогенате печени уровень продукции первичных свободно-радикальных агентов, регистрируемый в антигенактивированной реакции с люцигенином, выше в том числе и контрольных показателей.

–  –  –

Из данных, представленных на рисунке 19, видно, что значение максимума интенсивности хемилюминесцентной реакции с люминолом в гомогенате печени у животных, облучаемых ежедневно в течение 1 ч (группа 2), ниже как при спонтанной, так и при активированной реакции. Повышение продукции АФК также регистрировали в образцах, полученных у животных, подвергавшихся воздействию ЭМИ СВЧ-диапазона ежедневно в течение 3 ч (группа 3).

Данные, представленные в этой главе, обобщены на рисунке 20.

Абиотический фактор Фактор внутренней среды организма АКЭ ЭМИ СВЧ

–  –  –

Организм находится в постоянной взаимосвязи с окружающей средой.

Интенсивность обмена веществ с внешней средой и скорость внутриклеточных реакций поддерживают постоянство внутренней среды и целостность организма. Одним из первичных регуляторов уровня в крови веществ, поступающих в организм, является печень, как активно метаболизирующая часть организма. Изучение всех аспектов биохимии печени позволит видеть ее участие в работе всего организма при воздействии факторов внешней среды и поддержании гомеостаза в целом.

Исследования проводили на крысах породы Wistar массой 200–250 г. В эксперименте животные были разделены на две группы: контрольную и экспериментальную (рисунок 21).

–  –  –

Рисунок 21 – Схема эксперимента Животные группы 2 подвергались облучению ЭМИ СВЧ-диапазона в установке (1 ГГц, ППЭ 70 мкВт/см2) по 3 часа ежедневно в течение 5 суток.

Животные группы 1 (контроль) находились в таких же условиях, но были изолированы от источника ЭМИ СВЧ-диапазона.

После окончания облучения печень извлекали и подключали к установке для перфузии органов мелких лабораторных животных. Отток желчи проводили с применением полиэтиленового катетера.

В результате проделанной работы были получены физиологические и биохимические характеристики функционирования изолированной перфузируемой печени крыс после воздействия электромагнитного излучения СВЧ-диапазона.

У животных группы 1 во время перфузии изолированной печени после облучения животного наблюдали повышение давления в воротной вене (рисунок 22), что свидетельствует о спазме сосудов органа, у животных группы 2 сосуды печени реагировали более стабильно: сопротивление сосудов в ходе эксперимента практически не изменялись, а значения располагались ниже контрольной кривой, что может свидетельствовать о возможном усилении микроциркуляции и отсутствии спазма сосудов органа после воздействия ЭМИ СВЧ-диапазона на животное в установке. Подъем значений в начале перфузии печени животных контрольной группы связан со спазмом сосудов как следствие гипоксического состояния во время выделения органа [115].

Наблюдаемые изменения содержания кислорода в перфузате после трехчасового ежедневного воздействия ЭМИ СВЧ-диапазона отражают потребление кислорода тканями изолированного перфузируемого органа, как и печенью животных контрольной группы (рисунок 23). Динамика сопротивления сосудов печени и динамика потребления кислорода органом во время изолированной перфузии свидетельствует о взаимосвязи уровня кислорода и изменений микроциркуляции перфузата в изолированном органе.

–  –  –

Рисунок 22 – Изменение давления в воротной вене изолированной перфузируемой печени крыс. По оси ординат – давление (относительные единицы), по оси абсцисс – время перфузии изолированной печени

–  –  –

Рисунок 23 – Динамика содержания кислорода в оттекающем от изолированной печени перфузате. По оси ординат – концентрация кислорода (относительные единицы), по оси абсцисс – время перфузии изолированной печени Основная роль печени в углеводном обмене заключается в обеспечении постоянства концентрации глюкозы в крови. Это достигается регуляцией между процессами синтеза и распада гликогена, депонируемого в печени.

В течение всего эксперимента наблюдали стабильное потребление глюкозы печенью (рисунок 24) животных как экспериментальных, так и контрольной групп. Достоверные различия содержания глюкозы в оттекающем от печени перфузате между экспериментальными группами и контролем отсутствовали.

Отн.ед.

1,2 0,8

–  –  –

Рисунок 24 – Динамика содержания глюкозы в оттекающем от изолированной печени перфузате По оси ординат – концентрация глюкозы (относительные единицы), по оси абсцисс – время перфузии изолированной печени На рисунке 25 представлено изменение содержания лактата в оттекающем от органа перфузате в контрольной и экспериментальной группах. В контрольной группе прослеживается тенденция к колебаниям концентраций лактата, после облучения этого не наблюдалось.

При сравнении рисунков 23 и 25 можно видеть, что у животных экспериментальной группы содержание лактата в оттекающем от печени перфузате в течение первых 60 мин перфузии снижается сильнее, чем в пробах перфузата, оттекающего от печени животных контрольной группы в то время как содержание кислорода в пробах экспериментальной группы не превышает контрольные значения. Возможно, это результат компенсаторного переключения метаболизма с аэробного пути на анаэробный для поддержания жизнеспособности органа.

–  –  –

Рисунок 25 – Динамика содержания лактата в оттекающем от изолированной печени перфузате. По оси ординат – концентрация лактата (относительные единицы), по оси абсцисс – время перфузии изолированной печени Кроме того, у животных группы 2 наблюдали небольшое повышение содержания лактата, за которым следует стабильное понижение. Исходя из этого, можно предположить перераспределение субстратных потоков в направлении глюконеогенеза. Это согласуется с литературными данными о том, что электромагнитное излучение СВЧ-диапазона (900 МГц) способно усиливать реакции синтеза в клетках различных тканей лабораторных животных, одновременно активируя свободно-радикальное окисление [139– 143].

Таким образом, после воздействия ЭМИ СВЧ-диапазона на организм животного в печени сохраняется нормальное течение метаболических процессов, что способствует выполнению органом своих функций и формированию адаптации к действию фактора внешней среды.

3.3. Физиологические и метаболические изменения клеток в суспензии в ответ на воздействие ЭМИ СВЧ-диапазона Клетки активно взаимодействуют с окружающей средой, постоянно поддерживая структуру и функцию согласно изменяющимся потребностям и влиянию внеклеточных стрессовых факторов. Как правило, клетки поддерживают нормальный гомеостаз в довольно узком диапазоне физиологических параметров и, подвергаясь действию факторов внешней среды, резко меняющих условия существования, могут адаптироваться, достигая при этом нового устойчивого состояния и сохраняя функцию. Воздействие, превышающее адаптационные возможности, приводит к необратимым нарушениям обменных процессов и к гибели клетки. Исходя из этого, рассмотрены изменения, происходящие на уровне клеток под действием ЭМИ СВЧ-диапазона.

В качестве модели быстроразвивающейся клеточной популяции использовали экспериментальную опухоль – асцитную карциному Эрлиха.

Клетки асцитной карциномы Эрлиха у животного забирали на 5, 7, 9, 11, 12, 13, 15 сутки развития опухоли в организме животного. В эксперименте АКЭ разделяли на три группы: группа 1 – контроль, клетки групп 2 и 3 помещали в электромагнитное поле СВЧ-диапазона, в качестве облучателя использовали сотовый телефон, находящийся на расстоянии не более 1 см. В группе 2 воздействие производили телефоном Nokia 6300, а в группе 3 – Sony Ericsson W610i. После 30 мин воздействия электромагнитного поля производили измерения. Схема эксперимента представлена на рисунке 24.

В результате проведенной работы были получены данные о динамике гибели клеток в суспензии АКЭ после воздействия ЭМИ СВЧ-диапазона, которые представлены на рисунке 25.

–  –  –

Рисунок 24 – Схема эксперимента Изменение содержания погибших клеток в суспензии АКЭ в контрольной группе соответствует фазам развития опухоли в организме животногоопухоленосителя: плавное нарастание количества погибших клеток в суспензии АКЭ к 13 суткам отражает динамику изменения соотношения процессов пролиферации и гибели клеток опухоли. На 9 сутки опухоль входит в фазу стационарного роста. Зарегистрированные на 13 сутки подъем количества погибших клеток в суспензии и снижение на 15 сутки отражают то, что организм животного, у которого извлекали опухолевые клетки находится в последней фазе адаптации организма к развитию опухоли – фазе истощения (по Г. Селье) [144].

–  –  –

Рисунок 25 – Содержание погибших клеток в суспензии асцитной карциномы Эрлиха. По оси ординат – количество клеток (%), по оси абсцисс – сутки роста опухоли.

Увеличение количества погибших клеток в суспензии АКЭ после воздействия ЭМИ СВЧ на 5–7 сутки, может свидетельствовать о том, что клетки, находящиеся в стадии активной пролиферации, чувствительны к воздействию ЭМИ СВЧ-диапазона. Снижение к 11 суткам доли погибших клеток в суспензии может быть связано с переходом клеток опухоли в стационарную фазу роста и уравновешиванием процессов пролиферации и гибели в популяции клеток АКЭ.

К 13 суткам увеличение количества погибших клеток в суспензии происходит как в контрольной, так и в экспериментальных группах, что свидетельствует о гибели самой опухоли, начавшейся в организме животного-опухоленосителя, воздействие же ЭМИ только усиливает этот процесс.

На рисунке 26 представлены данные по содержанию в суспензии АКЭ клеток с морфологически измененной клеточной мембраной (блеббинг).

–  –  –

Рисунок 26 – Содержание опухолевых клеток с измененной клеточной мембраной (блеббинг). По оси ординат – количество клеток (%), по оси абсцисс – сутки роста опухоли В экспериментальной группе содержание клеток с признаками блеббинга выше в несколько раз по сравнению с контролем. Динамика изменения содержания клеток с измененной клеточной мембраной в контроле свидетельствует о том, что количество клеток в состоянии функциональной активности в период пролиферации возрастает. При воздействии ЭМИ морфологические изменения мембраны имели место на всех стадиях развития опухоли, причем если на 5 сутки увеличение количества клеток с признаками блеббинга было двукратным, то на 7–9 сутки – почти в 10 раз выше относительно контроля. Если полагать, что состояние блеббинга предшествует гибели клетки путем апоптоза, то, сравнивая данные рисунков 25 и 26, можно видеть, что увеличение количества клеток в состоянии блеббинга (начиная с 11 суток) предшествует увеличению доли погибших клеток в суспензии на 13 сутки развития опухоли.

Существенная роль в регуляции процессов, происходящих в мембранах, принадлежит их микровязкости – комплексному показателю, который отражает как структурные, так и функциональные (диффузионные) аспекты липидной составляющей мембраны. Изменения микровязкости мембраны тесно связаны с метаболическими изменениями, происходящими в клетке [107].

Изменения микровязкости мембран опухолевых клеток регистрировали в зоне белок – липидных и липид – липидных контактов. Общая динамика показателей микровязкости мембран в контрольной и экспериментальных группах имеет сходный характер. В зоне липид – липидных контактов наблюдается постепенное снижение микровязкости мембран клеток АКЭ (рисунки 27–30).

–  –  –

Рисунок 27 – Микровязкость мембран клеток АКЭ в зоне белок–липидных взаимодействий в группах 1 и 2. По оси ординат – относительная микровязкость (относительные единицы), по оси абсцисс – сутки роста опухоли

–  –  –

Рисунок 28 – Микровязкость мембран клеток АКЭ в зоне белок–липидных взаимодействий в группах 1 и 3. По оси ординат – относительная микровязкость (относительные единицы), по оси абсцисс – сутки роста опухоли Значение показателя микровязкости в зоне взаимодействий белок–липид изменяется: на 5, 9, 13 сутки оно выше, чем на 7, 11, 15 (рисунки 27–28).

Вероятно, это отражает динамику роста опухоли с изменением функционального состояния опухолевых клеток при переходе из одной стадии роста в другую и не связано с воздействием ЭМИ СВЧ-диапазона.

Следует отметить значения показателя микровязкости, полученные на 13 сутки роста опухоли, динамика которого отличается от данных, полученных в другие сутки исследования опухолевых клеток. Микровязкость в зонах белок – липидных и липид – липидных взаимодействий претерпевает изменения противоположного характера: текучесть мембраны резко снижается в зоне белок

– липидных контактов и возрастает в зоне липид – липидных контактов. Такие деструктивные изменения, вероятно, и приводят к увеличению количества погибших клеток в суспензии АКЭ, и наблюдаемый эффект связан с процессом гибели самой опухоли.

Достоверное изменение микровязкости мембран в зоне липид – липидных и белок – липидных взаимодействий при воздействии ЭМИ СВЧ-диапазона наблюдали только на 7 сутки развития опухоли. При этом в каждом эксперименте микровязкость мембран в зоне белок – липидных взаимодействий возрастает при воздействии ЭМИ СВЧ по отношению к контролю, а в зоне липид – липидных контактов снижается. Можно полагать, что на 7 сутки значительное возрастание количества погибших клеток и клеток в состоянии блеббинга связано с изменениями микровязкости плазматической мембраны опухолевых клеток.

–  –  –

Рисунок 29 – Микровязкость мембран клеток АКЭ в зоне липид – липидных взаимодействий в группах 1 и 2. По оси ординат – относительная микровязкость (относительные единицы), по оси абсцисс – сутки роста опухоли

–  –  –

Рисунок 30 – Микровязкость мембран клеток АКЭ в зоне липид – липидных взаимодействий в группах 1 и 3. По оси ординат – относительная микровязкость (относительные единицы), по оси абсцисс – сутки роста опухоли Состояние клеточных мембран тесно связано с внутриклеточными метаболическими процессами. Достаточно высокой информативностью при оценке метаболизма клеток обладают дегидрогеназы, поскольку они осуществляют ключевые реакции метаболизма и переключение субстратных потоков между сопряженными метаболическими путями [104, 145]. В связи с этим в динамике роста опухоли в клетках измеряли активность ключевых дегидрогеназ: Г6ФДГ, ГР, ЛДГ, обр.ЛДГ, НАДМДГ, Обр.НАДМДГ, НАДГДГ после воздействия ЭМИ СВЧ (в качестве источника электромагнитного поля использовали сотовый телефон Sony Ericsson W610i, 900 МГц, 9 мкВ/см2), клетки контрольной группы находились в таких же условиях, но воздействию не подвергались.

Как следует из данных, представленных на рисунке 31, активность Г6ФДГ снижается в контроле (группа 1) к 15 суткам развития опухоли, в то время как при облучении клеток (группа 2) происходит повышение активности Г6ФДГ на 9, 11 и особенно заметно на 15 сутки развития опухоли. Глюкозо-6-фосфат дегидрогеназа является инициирующим ферментом пентозофосфатного пути превращения глюкозы в клетках, локализованным в цитоплазме. Г6ФДГ обеспечивает образование клеточного НАДФН из НАДФ [145-147].

Полученный в результате реакции НАДФH необходим для поддержания уровня восстановленного глутатиона в клетке. Повышение активности Г6ФДГ может свидетельствовать об активизации этого метаболического пути и перераспределении части глюкозы с энергетических нужд клетки на пластические процессы. Снижение уровня активности Г6ФДГ отражает замедление переноса продуктов липидного катаболизма на окислительновосстановительные реакции гликолиза.

Реакцию, катализируемую Г6ФДГ, с кинетической точки зрения можно рассматривать как двусубстратную реакцию, протекающую с участием субстрата и кофермента, выполняющего роль второго субстрата. Фермент очень сильно ингибируется возрастающей концентрацией НАДФН и АТФ, по типу конкурентного ингибирования. Ферментом, который использует энергию НАДФН (образовавшегося в результате деятельности Г6ФДГ), является ГР, восстанавливающий дисульфидную связь окисленного глутатиона до его сульфгидрильной формы [145, 148-151].

Поскольку в результате деятельности Г6ФДГ образуется НАДФН, необходимый для регенерации восстановленного глутатиона, возрастание активности Г6ФДГ можно рассматривать как элемент адаптационной реакции клетки. Это утверждение согласуется и с данными литературы, в которых показано увеличение активности Г6ФДГ при ряде экстремальных воздействий, коррелирующее с повышением в клетке концентрации НАДФН и восстановленного глутатиона [89, 104, 151].

–  –  –

Рисунок 31 – Активность Г6ФДГ в клетках АКЭ без воздействия и после облучения сотовым телефоном. По оси ординат – активность фермента, выраженная в мкЕ в пересчете на 1 г белка, по оси абсцисс – сутки роста опухоли На рисунке 32 представлена активность ГР в клетках АКЭ до и после облучения. Как следует из представленных данных, на 7 сутки активность ГР в клетках, подвергавшихся воздействию электромагнитного поля, выше, чем в контроле. При этом с увеличением «возраста» опухоли происходит снижение активности фермента как в экспериментальной, так и в контрольной группах.

Резонно было бы ожидать, что активность ГР будет изменяться синхронно с изменением активности Г6ФДГ, но наблюдаемые изменения носят несогласованный характер при воздействии электромагнитного поля, излучаемого сотовым телефоном, что в свою очередь приводит к уменьшению способности клетки противостоять процессам свободно-радикального окисления макромолекул, развивающимся в результате экстремального воздействия.

–  –  –

Рисунок 32 – Активность ГР в клетках АКЭ без воздействия и после облучения.

По оси ординат – активность фермента, выраженная в мкЕ в пересчете на 1г белка, по оси абсцисс – сутки роста опухоли

–  –  –

Рисунок 33 – Активность ЛДГ (а) и обр.ЛДГ (б) в клетках АКЭ без воздействия и после облучения. По оси ординат – активность фермента, выраженная в мкЕ в пересчете на 1г белка, по оси абсцисс – сутки роста опухоли Такая картина обусловливает смещение равновесия между пируватом и лактатом в сторону уменьшения концентрации последнего в клетках АКЭ, подвергавшихся воздействию (группа 2) и увеличение содержания лактата в контрольной группе к 15 суткам. Поскольку пируват является предшественником ацетил-КоА, первичного субстрата ЦТК, снижение его концентрации может вызвать и снижение общего субстратного потока в этом цикле.

Малатдегидрогеназа – ключевой фермент цикла трикарбоновых кислот, катализирующий окислительно-восстановительную реакцию превращения малата в оксалоацетат. МДГ представлена двумя строго дифференцированными по локализации (митохондрии и цитоплазма) изоферментами, которые участвуют в функционировании системы сопряженных малатдегидрогеназных реакций («малатного» челнока), активно протекающих в митохондриях и цитоплазме гепатоцитов, роль которых состоит в обеспечении оксалоцетатом фосфоенолпируват-карбоксилазной реакции на начальных этапах глюконеогенеза.

Обр.НАДМДГ катализирует обратную реакцию цитратного цикла превращая оксалоацетат в митохондриальном матриксе при участии НАДН [145, 152].

Для МДГ также характерны отличия активности между начальными и поздними стадиями роста АКЭ (рисунок 34). Так, на 7 и 9 сутки активность фермента в группе 2 превышает значения активности контрольных значений, тогда как на 11–15 сутки, наоборот, активность фермента в клетках, подвергавшихся облучению, ниже, чем в контрольных.

Как видно из рисунка 34, изменение активности МДГ происходит не только в результате воздействия ЭМИ СВЧ-диапазона, но и в результате развития опухоли в организме животного. Увеличение активности МДГ приводит к усилению работы ЦТК, в результате чего образуется НАДН, который может использоваться в реакциях энергетического обмена клеток АКЭ. Снижение активности МДГ (рисунок 34) при одновременном понижении уровня активности обр.ЛДГ (рисунок 33 б) свидетельствует о рассогласовании процессов регуляции анаэробного и аэробного обменов в клетках АКЭ под действием ЭМИ СВЧ.

–  –  –

Рисунок 34 – Активность МДГ в клетках АКЭ без воздействия и после облучения.

По оси ординат – активность фермента, выраженная в мкЕ в пересчете на 1 г белка, по оси абсцисс – сутки роста опухоли Получение энергии в результате гликолиза приводит к образованию промежуточных метаболитов – лактата, пирувата. Вовлечение этих субстратов в ЦТК замедляется в следствие снижения уровня активности МДГ. Известно, что при таком сбое в регуляции углеводного обмена, опухолевые клетки способны выбрасывать накапливающиеся в них лактат и пируват в межклеточное пространство [153-156]. На уровне целого организма это будет приводить к увеличению содержания лактата и пирувата в периферической крови животныхопухоленосителей, вероятно этот эффект наблюдается в периферической крови животных (см. рисунок 14).

На стыке между пластическим и энергетическим обменами работают ферменты НАДГДГ и НАДФГДГ, обеспечивая поступление субстратов в ЦТК с аминокислотного обмена. Глутаматдегидрогеназа митохондриальный

– фермент, участвующий в обмене аминокислот. Катализирует обратимую реакцию превращения L-глутаминовой кислоты в -кетоглутаровую в цикле трикарбоновых кислот. Дегидрогеназе L-глутаминовой кислоты принадлежит большая роль в обмене не только белков, где глутаминовая кислота благодаря реакции переаминирования занимает ключевое значение, но также в обмене углеводов и жиров посредством образования или удаления путем аминирования

-кетоглутаровой кислоты. Она является единственной дегидрогеназой, катализирующей окислительное дезаминирование натуральных аминокислот Lконфигурации, действующей через пиридиновые нуклеотиды и обладающей активностью, достаточной для того, чтобы играть значительную биологическую роль [145].

Данные, описывающие изменение активности Обр.НАДГДГ в клетках асцитной карциномы Эрлиха в процессе роста опухоли в организме, представлены на рисунке 35.

–  –  –

Рисунок 35 – Активность Обр.НАДГДГ в клетках АКЭ без воздействия и после облучения. По оси ординат – активность фермента, выраженная в мкЕ в пересчете на 1 г белка, по оси абсцисс – сутки роста опухоли Из полученных результатов следует, что активность Обр.НАДГДГ как в контроле, так и в эксперименте на ранних стадиях роста АКЭ претерпевает незначительные изменения, тогда как на более поздних стадиях изменения более значимы в клетках, подвергавшихся облучению, чем в контроле. В ходе обратных реакций, катализируемых этой дегидрогеназой, синтезируется глутаминовая кислота, которая с существенной скоростью может подвергаться окислительному дезаминированию. Таким образом, оценка активности фермента для обратной реакции свидетельствует о снижении интенсивности субстратного потока с ЦТК на аминокислотный обмен при влиянии ЭМИ СВЧ-диапазона.

Поскольку активность исследуемых дегидрогеназ в клетках АКЭ изменяется в результате воздействия ЭМИ СВЧ-диапазона, генерируемого сотовым телефоном in vitro, возникает вопрос, существуют ли изменения метаболизма в клетках других тканей животных-опухоленосителей после воздействия на них СВЧ излучения.

Исследование проводили на клетках печени мышей-опухоленосителей.

Изменения метаболизма оценивали по динамике активности ферментов (Г6ФДГ;

ГР; НАДФГДГ; обр.НАДФГДГ; обр.НАДГДГ; НАДФИЦДГ), катализирующих окислительно-восстановительные процессы в клетках печени мышей.

Как следует из данных, представленных на рисунке 36, на 9 сутки после облучения гепатоцитов in vitro происходит повышение активности Г6ФДГ, а на 15 сутки развития опухоли в организме активность Г6ФДГ в гепатоцитах мышейопухоленосителей снижается по сравнению с результатами в контрольной группе.

Как и в клетках АКЭ, возрастание активности Г6ФДГ в клетках печени на 9 сутки развития опухоли в организме животного-опухоленосителя можно рассматривать как элемент адаптационной реакции, происходящей в гепатоцитах.

–  –  –

Рисунок 36 – Активность Г6ФДГ в гомогенате печени мышей с АКЭ. По оси ординат – активность фермента, выраженная в мкЕ в пересчете на 1 г белка, по оси абсцисс – сутки роста опухоли Реакции окислительного этапа пентозофосфатного пути служат основным источником НАДН в клетках, гидрированные коферменты снабжают энергией биосинтетические процессы, окислительно-восстановительные реакции, включающие защиту от активных форм кислорода [145, 147].

На рисунке 37 представлена активность ГР в печени мышей с АКЭ. Как следует из представленных данных, активность фермента ГР в клетках, подвергавшихся облучению ЭМИ СВЧ-диапазона, возрастает на протяжении всего времени исследования. На 15 сутки развития опухоли в организме регистрировали наибольшее значение активности фермента в гепатоцитах после воздействия электромагнитного поля.

–  –  –

Рисунок 37 – Активность ГР в гомогенате печени мышей с АКЭ. По оси ординат – активность фермента, выраженная в мкЕ в пересчете на 1 г белка, по оси абсцисс

– сутки роста опухоли Повышение активности ГР при снижении активности Г6ФДГ в гепатоцитах указывает на разбалансировку обменных процессов в клетках печени на фоне развития терминальной стадии роста асцитной карциномы Эрлиха и, возможно, активации процессов свободно-радикального окисления в клетках.

Перераспределение субстратов между пластическим и энергетическим обменами осуществляют ферменты НАДГДГ и НАДФГДГ.

Из полученных значений активности Обр.НАДГДГ (рисунок 38) следует, что в клетках печени как в контрольной группе, так и при облучении на ранних стадиях развития опухоли в организме активность Обр.НАДГДГ претерпевает незначительные изменения, тогда как на более поздних сроках наблюдается снижение активности фермента после воздействия ЭМИ СВЧ-диапазона. В ходе обратных реакций, катализируемых этой дегидрогеназой, синтезируется глутаминовая кислота.

Таким образом, как и клетки АКЭ на 15 сутки развития опухоли в организме, клетки печени мышей-опухоленосителей не нуждаются в аминокислотах как метаболическом топливе.

–  –  –

Рисунок 38 – Активность Обр.НАДГДГ в гомогенате печени мышей с АКЭ. По оси ординат – активность фермента, выраженная в мкЕ в пересчете на 1 г белка, по оси абсцисс – сутки роста опухоли

–  –  –

Рисунок 39 – Активность НАДФГДГ в гомогенате печени мышей с АКЭ. По оси ординат – активность фермента, выраженная в мкЕ в пересчете на 1 г белка, по оси абсцисс – сутки роста опухоли На рисунке 40 представлены изменения активности НАДФГДГ для обратной реакции, откуда следует, что к 9 суткам развития опухоли в организме в гепатоцитах после воздействия электромагнитного поля наблюдается повышение активности Обр.НАДФГДГ, а затем происходит резкое снижение активности, в то время как в гепатоцитах, не подвергавшихся воздействию, повышение активности наблюдается к суткам развития опухоли в организме животногоопухоленосителя и лишь потом – падение активности Обр.НАДФГДГ.

Результаты, представленные на рисунке 41, свидетельствуют о том, что динамика активности НАДФИЦДГ в гепатоцитах при облучении сходна с динамикой при воздействии. Происходит повышение активности фермента к 11 суткам, после чего к 15 суткам активность снижается.

120 группа 1

–  –  –

Рисунок 40 – Активность Обр.НАДФГДГ в гомогенате печени мышей с АКЭ. По оси ординат – активность фермента, выраженная в мкЕ в пересчете на 1 г белка, по оси абсцисс – сутки роста опухоли

–  –  –

Рисунок 41 – Активность НАДФИЦДГ в гомогенате печени мышей с АКЭ. По оси ординат – активность фермента, выраженная в мкЕ в пересчете на 1 г белка, по оси абсцисс – сутки роста опухоли В силу своей, преимущественно внемитохондриальной, локализации этот фермент обычно не принимает участия в работе ЦТК. Считается, что в норме его физиологическая роль состоит в регенерации НАДФН. Однако при снижении интенсивности субстратного потока и недостатке водорода в митохондриях, НАДФИЦДГ может включаться в ЦТК в качестве вспомогательного фермента, катализирующего образование -кетоглутарата [145]. Следовательно, снижение активности НАДФИЦДГ также имеет неблагоприятные последствия для скорости субстратного потока по ЦТК.

Одним из возможных механизмов изменения активности ферментов могут являться индуцированные ЭМИ СВЧ-диапазона конформационные изменения в структуре белковых молекул в связи с изменением дипольного момента [157-159]. Изменение конформации фермента приводит к нарушению нормального течения биохимических реакций в клетке [146–152, 158, 159].

Также известно, что при ряде патологических состояний, в том числе и при развитии опухоли в организме, происходит снижение скорости реакций окислительного фосфорилирования даже при достаточном уровне кислорода в тканях. Это происходит из-за повышенного уровня транскрипции генов, отвечающих за реакции гликолиза, и/или снижение уровня транскрипции генов, ответственных за протекание реакции ЦТК [160, 161].

Схема, обобщающая результаты, полученные в эксперименте о метаболических изменениях в клетках при воздействии ЭМИ СВЧ-диапазона, приведена на рисунке 42.

ЭМИ СВЧ

–  –  –

Рисунок 42– Общая схема изменений происходящих в клетках в ответ на действие ЭМИ СВЧ-диапазона. Стрелками показаны направления изменений представленных параметров Таким образом, наблюдаемая динамика активности дегидрогеназ, как в клетках асцитной карциномы Эрлиха, так и в гепатоцитах мышейопухоленосителей после воздействия электромагнитного излучения СВЧдиапазона свидетельствует о нарушении согласованности процессов окислениявосстановления в клетках, что в свою очередь может являться причиной изменения вязкости мембран клеток и возрастания в суспензии количества погибших клеток АКЭ и клеток в состоянии блеббинга.

Заключение Подводя итог результатам проделанной работы, можно заключить, что электромагнитное излучение на частотах, соответствующих диапазону работы систем сотовой связи, является стресс-фактором, вызывающим в организме млекопитающих цепь неспецифических характерных реакций.

Скоординированная деятельность механизмов гомеостаза в нормальных условиях работы организма обеспечивает транспорт необходимых субстратов и кислорода к месту их использования, эффективную утилизацию этих субстратов и удаление конечных продуктов окисления. Под действием абиотического фактора окружающей среды – сверхвысокочастотного электромагнитного излучения – нормальное течение этих процессов может нарушаться, в результате чего возникает абсолютная или относительная недостаточность биологических энергетических реакций, которая в свою очередь приводит к разнообразным структурно-функциональным нарушениям. Эти нарушения проявляются на уровне организма как стресс. Во время стресса максимально активизируются функции основных защитных систем организма, поддерживая, насколько это возможно, гомеостаз.

Результаты выполненной работы демонстрируют изменения метаболизма, происходящие как на уровне целого организма, так и на клеточном уровне у здоровых животных и животных-опухоленосителей. Биохимическими процессами, преобладающими в организме под действием электромагнитного излучения сверхвысокочастотного диапазона, являются процессы расщепления биологических макромолекул с целью получения дополнительной энергии, которым сопутствует усиление генерации активных форм кислорода.

В результате действия ЭМИ СВЧ-диапазона у здоровых животных возникали признаки адаптации, а у животных-опухоленосителей дезадаптации.

– Критическая точка – суммарное время воздействия ЭМИ СВЧ-диапазона 12 ч.

Важно отметить, что адаптационная реакция на действие электромагнитного излучения сверхвысокочастотного диапазона у здоровых животных гораздо ярче выражена, чем у животных-опухоленосителей. Вероятно, действие факторов опухолевого процесса, связанных с ростом асцитной карциномы Эрлиха преобладает над действием внешнего фактора – электромагнитного излучения, т.е. для организма более существенным является «борьба» с опухолевой прогрессией. Возможно, адаптационный эффект у животных-опухоленосителей так и не наступает, в отличие от здоровых животных.

С другой стороны, было обнаружено, что при воздействии на суспензию опухолевых клеток ЭМИ СВЧ-диапазона в ней наблюдали резкое уменьшение содержание клеток АКЭ, в основе которого лежат такие процессы как нарушение микровязкости мембраны и запуск запрограммированной гибели. Этот эффект может быть использован для моделирования процессов элиминации опухолевых клеток из организма.

Наблюдаемые нами метаболические изменения в гепатоцитах и клетках АКЭ, вероятно, тесно связаны с чувствительностью клеток к ЭМИ СВЧдиапазона, реализующейся посредством деформационной неустойчивости, возникающей при высоких напряженностях электрического поля в клеточной мембране. Эта неустойчивость приводит к резкому изменению диффузионной «прозрачности» плазматической мембраны клеток, чем, по-видимому, можно объяснить перераспределение метаболических потоков при получении энергии клетками, а возможно, и к деструктивным изменениям мембраны клеток АКЭ в суспензии.

Для детализации механизмов и оценки рисков влияния ЭМИ в диапазоне частот работы систем сотовой связи на биологические системы необходимы междисциплинарные исследования с использованием многоуровневых подходов.

В данной работе была предпринята попытка реализации такого подхода в исследовании – выявление закономерностей влияние электромагнитного поля сверхвысокочастотного диапазона на разном уровне организации биологических систем. Полученные результаты работы обобщены в схеме, представленной на рисунке 43.

–  –  –

Адаптация Резистентность Резистентность Дезадаптация Гибель Рисунок 43 – Реакция здорового животного и животного-опухоленосителя на воздействие электромагнитного излучения сверхвысокочастотного диапазона

–  –  –

1. В процессе адаптации организма к действию электромагнитного излучения сверхвысокочастотного диапазона (1 ГГц, 70 мкВт/см2) наблюдается компенсаторная реакция, проявляющаяся в смене энергетического субстрата: у здоровых животных в энергетический обмен вовлекаются белки, а у животныхопухоленосителей – преимущественно липиды.

2. В ответ на ежедневное воздействие электромагнитного излучения сверхвысокочастотного диапазона суммарной продолжительностью ч происходит выброс в периферическую кровь крупных незрелых эритроидных клеток. Реакция нормализуется после 12 ч воздействия.

3. Увеличение продолжительности воздействия электромагнитного излучения сверхвысокочастотного диапазона (1 ГГц, 70 мкВт/см2) на организм здоровых крыс приводит к увеличению продукции активных форм кислорода в гомогенате печени. В то же время функциональные изменения в печени в условиях перфузии изолированного органа отсутствуют.

4. Действие электромагнитного излучения сверхвысокочастотного диапазона (900 МГц, 7–9 мкВт/см2) на суспензию клеток асцитной карциномы Эрлиха в процессе роста опухоли приводит к увеличению содержания погибших клеток на фоне наблюдающихся морфологических и биохимических изменений.

У здоровых животных электромагнитное излучение 5.

сверхвысокочастотного диапазона после 12 ч суммарного воздействия приводит к развитию реакции адаптации. У животных-опухоленосителей фактор внешней среды – электромагнитное излучение сверхвысокочастотного диапазона – и внутренний фактор – асцитная карцинома Эрлиха – действуют синергично, приводя к гибели животного.

Использование полученных результатов и практические рекомендации

1. Результаты исследований используются в учебном процессе студентов Института управления, экономики и природопользования ФГАОУ ВПО «Сибирский федеральный университет» в курсе «Экологические проблемы освоения природных ресурсов», ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф.ВойноЯсенецкого» в курсе «Медицинская и биологическая физика» и ФГБОУ ВПО «Сибирский государственный аэрокосмический университет имени академика М.Ф.Решетнева» в курсе «Безопасность жизнедеятельности».

2. Полученные результаты по изменениям диаметров эритроцитов в условиях воздействия ЭМИ СВЧ-диапазона на организм животных могут быть использованы при выполнении НИР в Красноярском филиале ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава РФ и в ФГБУ «НИИ Медицинских проблем Севера» СО РАМН.

–  –  –

1. Kovacic, P. Electromagnetic fields: mechanism, cell signaling, other bioprocesses, toxicity, radicals, antioxidants and beneficial effects / Kovacic P., Somanathan R. // Journal of Receptors and Signal Transduction Research. – 2010. – Vol. 30, № 4. – P. 214–226.

2. Kumar, S. Evaluation of genotoxic effects in male Wistar rats following microwave exposure / Kumar S., Kesari K.K., Behari J. // Indian Journal of Experimental Biology. – 2010 – Vol.48, №6. – Р 586–592.

3. Григорьев, Ю.Г. Возможность развития опухолей мозга у пользователей сотовыми телефонами (научная информация к решению международного агентства по исследованию рака (IARC)от 31 мая 2011 г.) / Григорьев Ю.Г. // Радиационная биология. Радиоэкология. – 2011. – T. 51, № 5. – C. 633–638.

4. Григорьев, Ю.Г. Мобильная связи и здоровье населения: оценка опасности, социальные и этические проблемы / Григорьев Ю.Г., Григорьев О.А. // Радиационная биология. Радиоэкология. – 2011. – Т.51, №3. – С.357–368.

5. Перов, С.Ю. Инструментальная дозиметрия радиочастотных электромагнитных излучений: общие принципы и современная методология / Перов С.Ю., Ю.Б. Кудряшов, Н.Б. Рубцова // Радиационная биология.

Радиоэкология. – 2012. – T. 52, № 3. – C. 276–281.

6. Kesari, K.K. Pathophysiology of microwave radiation: effect on rat rain / Kesari K.K., Jitendra Behari S.K. // Appl Biochem Biotechnol. – 2012. – № 166. – Р. 379–388.

7. Aydin, B. Effect of 900 MHz radiofrequency radiation on oxidative stress in rat brain and serum / Aydin B, Akar A. // Electromagnetic Biology and Medicine. – 2013. – Vol. 32, № 1. – P. 20–29.

8. Grenier, K. Recent advances in microwave-based dielectric spectroscopy at the cellular level for cancer investigations / Grenier K., Dubuc, D., Chen, T., Artis, F., Chretiennot, T., Poupot, M., Fournie, J. // Microwave Theory and Techniques, IEEE Transactions on. – 2013. –Vol. 61, Issue 5. – P. 2023–2030.

9. Баджинян, С.А. Влияние электромагнитного излучения с частотой 900 МГц на некоторые показатели крови / Баджинян С. А., Малакян М. Г., Егиазарян Д. Э., Агджоян Р. Л., Абрамян Л. Э. // Радиационная биология. Радиоэкология. – 2013. – T. 53, № 1. – C. 63–70.

10.Bilgici, B. Effect of 900 MHz radiofrequency radiation on oxidative stress in rat brain and serum / Bilgici B., Akar A., Avci В., Tuncel O.K. // Electromagnetic Biol.

and Med. – 2013. – Vol. 32, № 1. – P.20–29.

11.Кочемарова, Ю.В. Формирование электромагнитной нагрузки на территории г. Красноярска / Кочемарова Ю.В., Кочемарова Е.В. // Сложные системы в экстремальных условиях: тезисы докладов XV Всероссийского симпозиума с международным участием. – Красноярск, 2010. – С. 43.

12.Жуль, Е.Г. Формирование электромагнитной нагрузки в условиях городской среды / Жуль Е.Г., Моргулис И.И., Кочемарова Ю.В. // Вестник КрасГАУ. – 2008. – №5. – С. 291–296.

13.Стрельников, В.В. Экологическое нормирование: учебник /В.В.

Стрельников, Н.В. Чернышева. – Краснодар: Издательский Дом – Юг, 2012. – 472с.

14.Григорьев, Ю.Г. Новые данные для доказательств наличия значимых эффектов при хроническом электромагнитном облучении (к аутоиммунным изменениям у крыс) / Григорьев Ю.Г., Шафиркин А.В., Носовский А.М. // Радиационная биология. Радиоэкология. – 2011. – T. 51, №6. – с. 721–730.

15.Ammari, M. Exposure to GSM 900 MHz electromagnetic fields affects cerebral cytochrome c oxidase activity / Ammari M., Lecomte A., Sakly M., Abdelmelek H., De-Seze R. // Toxicology. – 2008. – Vol. 250, №1. Р. 70–4.

16.Apollonio, F. Mixedquantum-classical methods for molecular simulations of biochemical reactions with microwave fields: The case study of myoglobin / Apollonio F., Liberti M., Amadei A., Aschi M., Pellegrino M., D’Alessandro M., D’Abramo M., Di Nola A., d’Inzeo G. // IEEE Trans. Microw. Theory Techn. – 2008. – Vol. 56, № 11.

– Р. 2511–2519.

17.Adamantia, F. Brain proteome response following whole body exposure of mice to mobile phone or wireless DECT base radiation / Fragopoulou A.F., Samara A., Antonelou M.H., Xanthopoulou A., Papadopoulou A., Vougas K., Koutsogiannopoulou E., Anastasiadou E., Stravopodis D.J., Tsangaris G.T., Margaritis L.H. // Electromagnetic Biology and Medicine. – 2012. – Vol. 31, № 4 – Р. 250–274.

18.Blank, M. Electromagnetic fields stress living cells / Blank M., Goodman R. // Pathophysiology. – 2009. – № 16. – P. 71–78.

19.El-Bediwi, A.B. Effects of electromagnetic radiation produced by mobile phone on some viscral organs of rat / El-Bediwi A.B., El-kott A., Saad M., Eman E. // Journal of Medical Sciences. – 2011. – Vol. 11, № 6. P. 256–260.

20.Stam, R. Electromagnetic fields and the blood-brain barrier / Stam R. // Brain research reviews. – 2010. – №6. – Р. 80–97.

21.Ozgur, E. Mobile phone radiation-induced free radical damage in the liver is inhibited by the antioxidants N-acetyl cysteine and epigallocatechin-gallate / Ozgur E., Guler G., Seyhan N. // International Journal of Radiation Biology. – 2010. – Vol. 86, №11. – P. 935–945.

22.Volkow, N.D. Effects of cell phone radiofrequency signal exposure on brain glucose metabolism / Volkow N.D., Tomasi D., Wang G.J., Vaska P., Fowler J.S., Telang F., Alexoff D., Logan J., Wong C. // Journal of the American Medical Association. – 2011. – Vol. 305, № 8. – P. 808–813.

23.Кудряшов, Ю.Б. Радиационная биофизика: радиочастотные и микроволновые электромагнитные излучения: учебник / Кудряшов Ю.Б., Перов Ю.Ф., Рубин А.Б. – М.: Физматлит, 2008. – 184 с.

24.Самойлов, В. О. Радиобиология неионизирующих и ионизирующих излучений: учебное пособие для студентов высших учебных заведений / Самойлов В. О., Владимиров В. Г., Шарова Л. А. – СПб: Изд-во Политехн.ун-та, 2011. – 208 с.

25. Ризниченко, Г.Ю. Лекции по математическим моделям в биологии. Ч. I./ Ризниченко Г.Ю. М, 2004. – 125 с.

26.Шилов, И.А. Экология / Шилов И.А. – М.: Высшая школа, 2003. – 512 с.

27.Железняков, В.В. Радиоизлучение Солнца и планет / Железняков В.В. – М., 1964. – 558 с.

–  –  –

29.Аполлонский, С.М. Электромагнитная экология человека: учебное пособие / Аполлонский С.М. Малаян К.Р. – СПб: Изд-во Политехн.ун-та, 2008. – 556 с.

30.Гордиенко, В. А. Физические поля и безопасность жизнедеятельности / Гордиенко В. А. – Из-во: Астрель, 2006. – 320 с.

31.Gaestel M. Biological monitoring of non-thermal effects of mobile phone radiation: recent approaches and challenges / Gaestel M. // Biological Reviews. – 2010.

– Vol. 85, № 3. – P. 489–500.

32.http://www.who.int

33.Classifies Radiofrequency Electromagnetic Fields as Possibly Carcinogenic to Humans [electronic resource] // PRESS RELEASE № 208, 31 May 2011. 3 p. [режим доступа http://www.who.int/ionizing_radiation/research/iarc/en]

–  –  –

36.Перов, С.Ю. Оценка информативности теоретических основ и ограничений расчетной дозиметрии радиочастотных электромагнитных излучений / Перов С.Ю., Ю.Б. Кудряшов, Н.Б. Рубцова // Радиационная биология.

Радиоэкология. – 2012. – T. 52, № 2. – C. 181–186.

37.Пальцев, Ю.П. Проблемы гармонизации гигиенических регламентов электромагнитных полей мобильных средств радиосвязи / Пальцев Ю.П., Походзей Л.В., Рубцова Н.Б., Богачева Е.В. // Гигиена и санитария. – 2013. – № 3.

– С. 39–42.

38.Баранов Н.Н. Электрофизические, медико-биологические и экологические проблемы сотовой связи в России / Баранов Н.Н., Климовский И.И. – М:

Издательский дом МЭИ, 2008. – 64с.

39.Foster, K.R. Thermal mechanisms of interaction of radiofrequency energy with biological systems with relevance to exposure guidelines/ Foster K.R., Glaser R. // Health Physics. – 2007. – Vol. 92, № 6. – P. 609–620.

40.Бецкий, О.В. Лечение электромагнитными полями / Бецкий О.В. // Биомедицинская радиоэлектроника. –2000. –№ 12. – С. 11–30.

41.Бецкий, О.В. Миллиметровые волны и живые системы / Бецкий О.В., Кислов В.В., Лебедева Н.Н. – М: Сайнс-пресс, 2004. – 272 с.

42.Грецова, Н.В. Описание воздействия микроволнового излучения низкой интенсивности на активный транспорт веществ через мембрану клетки / Грецова Н.В., М.В. Грецов, Ковалёв И.А. // Биомедицинская радиоэлектроника. – 2008. – №4. – C. 23–25.

43.Девяткова, Н.Д. Миллиметровые волны и их роль в процессах жизнедеятельности / Девяткова Н.Д., Голанта М.Б // Радио и связь. – 1991. – C.

168–171.

44.Михайлов, Н.Ю. Высокочастотные колебания в сигнале пульсовой волны и их связь с адаптационными реакциями / Н.Ю. Михайлов, Г.Н. Толмачев, И.Е.

Шепелев, П.С. Пляка // Биофизика. –2008. – № 3. – С. 482–487.

45.Оганян, В. Действие низкоинтенсивного когерентного электромагнитного излучения крайне высоких частот на параметры роста бактерий Enterococcus hirae / В. Оганян, А. Саркисян, А. Тадевосян, А. Трчунян // Биофизика. – 2008. – № 5. – С. 822–825.

46.Kerman, M. Oxidative stress in hippocampus induced by 900 MHz electromagnetic field emitting mobile phone: Protection by melatonin / Kerman M., Senol N. // Biomedical Research. – 2012. – Vol. 23, № 1. – P.147–151.

47.Li, X.M. In vitro free radical scavenging activities and effect of synthetic oligosaccharides on antioxidant enzymes and lipid peroxidation in aged mice / Li X.M., Shi Y.H., Wang F., Wang H.S., Le G.W. // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. – 2007. – Vol. 43, № 1. – Р. 364–70.

48.Masuda, H. Acute effects of local exposure to radio-frequency electromagnetic fields on the cerebral microcirculation in rats / Masuda H., Ushiyama A. // The 23 rd Annual Meeting of Bioelectromagnetic Society

Abstract

Book. – 2001. – Р. 139–140.

49.Masuda, H. Effects of acute exposure to a 1439 MHz electromagnetic field on the microcirculatory parameters in rat brain / Masuda H., Ushiyama A. // In Vivo. – 2007. – Vol. 21, № 4. – Р. 555–562.

50.Григорьев, О.А. Воздействие антропогенного электромагнитного поля на состояние и функционирование природных экосистем / О.А. Григорьев, Е.П.

Бичелдей, А.В. Меркулов // Радиационная биология. Радиоэкология. –2003. – № 5.

– С. 544–551.

51.Galeev, A. L. The effects of microwave radiation from mobile telepfones on humans and animals [electronic resource] / A. L. Galeev // Neuroscience and Behavioral № Режим доступа:

Physoilogy. – 2000. – 2. – http://www.springerlink.com/content/387360gh0715nu01 html.

52.Сарапульцева, Е.И. Исследование предельно допустимого уровня низкоинтенсивного электромагнитного излучения на частоте мобильной связи (1ГГц) по изменению двигательной активности Spirostomum Ambiguum / Е.И.

Сарапульцева, Ю.В. Иголкина, А.В. Литовченко // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. –2009. – № 4. – С. 411–413.

53.Bawin, S.M. Effects of modulated VHF fields on the central nervous system / Bawin S.M., Kaczmarek L.K., Adey W.R. // Annu. New York Acad. Sci.. – 1975. – Vol. 247. – P. 74–81.



Pages:   || 2 |
Похожие работы:

«МНОГОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ЦИФРОВЫЕ СИСТЕМЫ Руководство по эксплуатации для функций копирования РАСПАКОВКА И ЗАПУСК Отказ в работе аппарата по причине неправильного запуска не является гарантийным случаем. Если вы сомневаетесь в возможности запустить...»

«№ 4 (72) 2012 ЗОЛОТОЕ ДНО 2 ИНВЕСТИЦИИ В ТЕПЛО 8 ОТ СКВАЖИНЫ ДО БЕНЗОКОЛОНКИ 15 ЭКУ: КОРПОРАТИВНАЯ КУЗНИЦА КАДРОВ 22 ГРАД ЦАРЕВИЧА ДИМИТРИЯ 45 ЖУРНАЛ ОАО «ТАТНЕФТЬ» №4 (72) 2012 ИНТЕРВЬЮ Золотое дно интервью президента РТ Рустама Минниханова 2 РЕДАКЦИОННЫЙ СОВЕТ АНАЛИТИКА Ибрагимов Н.Г. первый заместитель...»

«В.Н. Адаев г. Тюмень Институт гуманитарных исследований Тюменского государственного университета Этнологическая экспертиза представляет собой одно из перспективных направлений исследовательской работы. Причём это то направление, которое по праву может носить эпитеты «прикладной» и «неотложной этнографии». Тем не менее в силу отсутс...»

«МИНОБРНАУКИ РОССИИ Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «ЮЖНЫЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» Б. А. Камкия ПОЛИТИЧЕСКИЙ КОНТЕКСТ И ПРОБЛЕМА БЮРОКРАТИИ: КОНЦЕПТОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ Ростов-на-Дону УДК 3...»

«R A/50/4 ОРИГИНАЛ: АНГЛИЙСКИЙ ДАТА: 1 АВГУСТА 2012 Г. Ассамблеи государств-членов ВОИС Пятидесятая серия заседаний Женева, 1-9 октября, 2012 года ОТЧЕТ О РЕАЛИЗАЦИИ ПРОГРАММЫ ЗА 2010/11 ГОДЫ представлен Генеральным директором 1. Настоящий документ содержит Отчет о реализации программы за 2010/11 годы (документ WO/PBC/19/2), которы...»

«АВТОРЫ: Кафедра ортопедической стоматологии ГОУ ДПО СПбМАПО: А.В. Цимбалистов д.м.н., профессор, заведующий кафедрой; И.В. Войтяцкая к.м.н., доцент кафедры; Т.А. Лопушанская к.м.н., доцент кафедры; А.А. Симоненко – соискатель кафедры; Л.Б. Петросян к.м.н., доцент кафедр...»

«УДК 639.371.5 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ 24-ЭПИБРАССИНОЛИДА ДЛЯ РАЗРАБОТКИ КОРМА НА ОСНОВЕ КАЛИФОРНИЙСКОГО ЧЕРВЯ EISENIA FOETIDA ДЛЯ КАРПОВЫХ РЫБ Е.П. Глеб, преподаватель-стажер, Е.С. Гук, преподаватель-стажер, Р.Э. Аксенова, 4 курс, В.П. Шоломицкий, лаборант Научный руководитель – В.В. Шумак, к.б.н., доцент...»

«АНТОНОВ Анатолий Иванович АНТОНОВ Анатолий Иванович, Чрезвычайный и Полномочный Посол, директор Департамента по вопросам безопасности и разоружения МИД РФ. Член Экспертноконсультативного Совета ПИР-Центра. Родился в 1955 г. В 1978 г. окончил Московский государственный институт международных отношений МИД СССР, в 1983 г. – аспирантуру...»

«1|Страница Запрос предложений № ЗП 16-07-21 на заключение договора цессии с коллекторским агентством для работы с проблемной задолженностью физических лиц – заемщиков Банка ГПБ (АО) в 3-х Лотах «Газпромбанк» (Акцио...»

«официальный дилер КОМПЛЕКТНОЕ УСТРОЙСТВО ШКАФ УПРАВЛЕНИЯ ГРАНТОР® типа АЭП с релейным регулированием Руководство по эксплуатации Руководство по эксплуатации «Комплектное устройство: шкаф управления ГРАНТОР® типа АЭП» КОМПЛЕКТНОЕ...»

«ГЛАВА 4. ГЛАВА 4. ЧИБИСОВ Сергей Михайлович, доктор меС.М. Чибисов, Г.С. Катинас, М.В. Рагульская БИОРИТМЫ И КОСМОС дицинских наук, академик Русской секции МАН, академии Естествознания, профессор кафедры общей патологии и патологической физиологии РУДН. Автор 380 публикаций по актуальным проблемам космобиосферных св...»

«testo 316-EX – детектор утечек газа Руководство пользователя 1 Безопасность и окружающая среда 1.1. Сведения о данном документе Использование Перед использованием внимательно прочтите данный документ и ознакомьтесь...»

«Глава 2 Энергетика ЭНЕРГЕТИКА Руководящие указания МГЭИК по эффективной практике и учет факторов неопределенности в национальных кадастрах парниковых газов 2.1 Энергетика Глава 2 СОПРЕДСЕДАТЕЛИ, РЕДАКТОРЫ И ЭКСПЕРТЫ Сопредседатели совещания экспе...»

«ЧЕШСКИЙ КОНДИЦИОНАЛ VS РУССКОЕ СОСЛАГАТЕЛЬНОЕ НАКЛОНЕНИЕ В ПОБУДИТЕЛЬНОМ ВЫСКАЗЫВАНИИ А.И. Изотов На последующих страницах мы попытаемся выявить специфику употребления чешского кондиционала по сравнению с русским сослагательным наклонением в составе независимых выска...»

«Рылова Анна Евгеньевна РИМСКИЙ ТЕКСТ Б. К. ЗАЙЦЕВА В статье рассматриваются основные характеристики римского текста Б. Зайцева. Впервые применительно к творчеству этого автора римский текст прослеживается по всем опубликованным произведениям разных жанров. Цель и...»

«РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВОЛГОГРАДСКОЙ ОБЛАСТИ «ВОЛГОГРАДСКИЙ ОБЛАСТНОЙ ЦЕНТР ЭКСПЕРТИЗЫ НА ТРАНСПОРТЕ» (ГБУ ВО «Волгоградэксперттранс) 400074, г.Волгоград, ул.Козловская, 32а тел. № 97-22-39 факс № 97-22-50, E-mail: sertif34@mail.ru ОКПО 67340099, ОГРН 1103460002601, ИНН/КПП 34451109...»

««ЯДЕРНОЕ СБЛИЖЕНИЕ» ИНДИИ И США: ЗА И ПРОТИВ1 Роберт Айнхорн Укрепление отношений с Индией и развитие стратегического партнерства с этой стра ной в XXI веке является важным национальным интересом США. Однако усилия по раз витию двухсторонних американо индийских отношений не должны противоречить дру гому национальному интересу США –...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Тольяттинский государственный университет ПРИКАЗ 10.09.2014 3106 О зачислении поступающих на первый курс То...»

«ПРЕПОДОБНЫЙ ИОАНН ДАМАСКИН ПАТРОЛОГИЯ Преподобный Иоанн Дамаскин ВВЕДЕНИЕ В ОСНОВЫ ДОГМАТИЧЕСКОГО БОГОСЛОВИЯ С р е д и м н о г о о б р а з н о г о наследия святого И о а н н а Д а м а с к и н а о с о ­ б о е место з а н и м а ю т е г о...»

«Утвержден КЮГН.465235.010ИМ-ЛУ ЦАТС “ПРОТОН-ССС” СЕРИЯ “АЛМАЗ” Инструкция по монтажу, пуску, регулированию и обкатке изделия КЮГН.465235.010ИМ КЮГН.465235.010ИМ Содержание 1 Общие указания 2 Меры безопасности 2.1 Требования к технике безопасности 3...»

«Из решения Коллегии Счетной палаты Российской Федерации от 20 июля 2012 года № 33К (866) «О результатах экспертно-аналитического мероприятия «Мониторинг и оценка эффективности размещения и использования средств Резервного фонда и Фонда национального благосостояния»: Утвердить отчет о рез...»

««ООО НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННАЯ КОМПАНИЯ «ЭТАНОЛ-КОМ» 640000, Курганская обл., г. Курган ул. Дзержинского, 70, стр. 5, стр. 8. Сайт: www.spirtzavod.com, Email: etanolcom@mail.ru Тел.: 8 (3522) 61-91-18, 8 (3522) 41-09-18, 8-912-529-00-31 БИОКОМБИКОРМОВАЯ УСТАНОВКА «Универсал 10 000/130 00...»

«Договор № об осуществлении технологического присоединения к электрическим сетям (для заявителей, в отношении которых Постановлением Правительства РФ № 861 от 27.12.2004г. не установлены типовые формы дог...»

«УТВЕРЖДЕНО директор ГБУ ДО ДООЦ «Маяк» А.А. Заикин Приказ №_ от «_» _ ПОЛОЖЕНИЕ О филиале Государственного бюджетного учреждения дополнительного образования «Детский оздоровительнообразовательный центр «Маяк»1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ 1.1. Филиал Государственного бюджетного учреждени...»

«Положение в отрасли и приоритетные направления деятельности Открытое акционерное общество «Российская инновационная топливно энергетическая компания» (ОАО «РИТЭК») – нефтедобывающее предприятие, спе...»

«Факультет землеустройства и кадастров Направление Землеустройство и кадастры Профиль Землеустройство Дисциплины: 1. Землеустройство 2. Земельный кадастр 1. Землеустройство 1. Внутрихозяйственное землеустройство. П...»

«Открытый бюджет на 2016 год Министерства юстиции Мурманской области Издание 4 август 2016 ФОТО Обращение министра юстиции Мурманской области! Сегодня особую актуальность приобретают вопросы открытости для населения деятельности органов...»

«ФАНТОМНЫЙ КУРС ТЕСТЫ АНАТОМО-ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ СТРОЕНИЯ ЗУБОВ 1. Коронки зубов имеют долотообразную форму. К какой группе зубов B Нижний второй моляр принадлежат эти зубы: C Верхний первый моляр А Нижние вторые моляры D Верхний второй моляр B Нижние премоляры E Нижний второй моляр? C Верхн...»

«УДК 821.111-312.9(73) ББК 84 (7Сое)-44 Т98 Mark Tufo ZOMBIE FALLOUT: A PLAGUE UPON YOUR FAMILY Печатается с разрешения издательства fdnjhf Перевод с английского Заура Мамедьярова Дизайн обложки Виктории Лебедевой Тюфо, Марк. Т98 Zombie Fallout: Чума на твою семью / Марк Тюфо; [пер. с  англ...»








 
2017 www.pdf.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - разные матриалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.