WWW.PDF.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Разные материалы
 

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 |

«МАТЕРИАЛЫ XLVIII МЕЖДУНАРОДНОЙ НАУЧНОЙ СТУДЕНЧЕСКОЙ КОНФЕРЕНЦИИ «Студент и научно-технический прогресс» 10–14 апреля 2010 г. БИОЛОГИЯ Новосибирск УДК 54 ББК 57 Материалы ХLVIII Международной ...»

-- [ Страница 4 ] --

Artemisia annua L. (полынь однолетняя) – это ценное лекарственное растение, используемое для получения лекарственных веществ сесквитерпеновой природы (артемизинина и его производных), Артемизинин – эндопероксидный сесквитерпеновый лактон, являющийся антималярийным препаратом, эффективным против штаммов малярийного плазмодия, устойчивых к действию синтетических лекарств. Главным способом получения артемизинина для фармакологического использования является извлечение его из выращенных растений и дальнейшая его очистка. Но количество артемизина, получаемого таким образом, переменно. Химический синтез этого препарата коммерчески не выгоден. Необходимо использование технологии культуры клеток для увеличения производства артемизинина.

Целью нашей работы является определение оптимальных условий для культивирования каллусной культуры Artemisia annua L. В качестве питательной среды использовалась среда Мурасиге–Скуга (MS) с добавлением фитогормонов НУК, 6-БАП и ГК3, а также различных субстратов роста: мио-инозитол, гидролизат казеина, активированный уголь. Каллусная культура Artemisia annua L. культивировалась при температуре 26 ± 1°C и освещенности 4000 Лк с периодом субкультивирования 15 дней.

В ходе проведения эксперимента нами было установлено, что наибольший прирост биомассы наблюдался на среде с добавлением фитогормонов НУК и БАП, а также с добавление мио-инозитола, в то время как применение других субстратов роста не давало такого эффекта.

Максимальный прирост воздушно-сухой массы был отмечен также на этой среде. Максимальные значения объемов клеток были отмечены в каллусной ткани, выращенной на среде с добавлением инозитола и ГК3, минимальные значения – у каллусной ткани, выращенной на средах с добавлением казеина, активированного угля и инозитола. Индекс роста каллусной культуры Artemisia annua L. увеличивается в 5 раз к концу периода субкультивирования.



Таким образом, оптимальной средой для культивирования каллусной культуры Artemisia annua L. является среда с добавлением фитогормонов НУК и БАП, а также среда с добавлением мио-инозитола.

Научный руководитель – С. В. Песяк.

ОДНОВРЕМЕННЫЙ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ

ИММУНОАНАЛИЗ ДВУХ ФОРМ ПРОЛАКТИНА В СЫВОРОТКАХ

–  –  –

Большинство существующих на сегодняшний день лабораторных тестсистем, используемых в клинической практике, способны определять лишь общее количество пролактина (лютеотропный гормон, вырабатываемый передней долей гипофиза) и напрямую не выявляют его свободную и связанную с иммуноглобулином (макропролактин) формы.

Между тем, определение макропролактина (биологически неактивного) необходимо для правильной диагностики и лечения больных с гиперпролактемией. Существующие способы выявления макропролактина с помощью гель-фильтрации или осаждением его полиэтиленгликолем трудоемки, неспецифичны и часто приводят к искажению полученных результатов.

Ранее было показано, что одновременное определение двух мишеней в одном образце можно осуществлять иммуноанализом с использованием в качестве репортеров двух вариантов Са2+-активируемого фотопротеина обелина с измененными спектрами биолюминесценции:

Y138F («зеленый мутант», max = 493 нм) и H22E W92F («фиолетовый мутант», max = 388 нм). При этом выделение сигнала от каждого репортера производится с помощью соответствующих широкополосных фотофильтров [1]. Аналогичный подход использовался при разработке способа одновременного иммуноанализа двух форм пролактина в сыворотке. При этом анализ проводили в микропланшетном формате и для разделения сигналов использовали не только разные спектральные, но и различные кинетические характеристики биолюминесцентных реакций репортерных белков.





Разработанный способ испытан при определении общего пролактина в стандартных и клинических сыворотках; показана корреляция полученных результатов с данными традиционного радиоиммуноанализа (РИА).

Проведен одновременный биолюминесцентный иммуноанализ двух форм пролактина в клинических сыворотках, результаты которого хорошо соотносились с результатами традиционного раздельного определения с помощью РИА.

______________________________

1. Frank L. A. et al. (2008) Anal. Bioanal. Chem., 391, p. 2891–2896.

Научный руководитель – канд. биол. наук Л. А. Франк.

ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ

К РАЗВИТИЮ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО СИНДРОМА У ЖИТЕЛЕЙ

ЗАПАДНО-СИБИРСКОГО РЕГИОНА РОССИИ

Е. А. Кудрявцева, Е. Н. Воронина, М. Л. Филипенко, Г. И. Лифшиц Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН Новосибирский государственный университет Метаболический синдром – это многофакторное заболевание, которое в большинстве случаев проявляется лишь тогда, когда выражено влияние факторов окружающей среды. В последние годы активно изучаются генетические факторы развития метаболического синдрома.

Целью данной работы является исследование роли аллельного полиморфизма генов TCF7L2, FTO, INSIG2, GNB3, ApoA5, PPAR, TNF и LPL в генетической предрасположенности к развитию метаболического синдрома у жителей Западно-Сибирского региона.

Определение полиморфных вариантов генов TCF7L2, FTO, INSIG2, GNB3, ApoA5 проводилось методом ПЦР-ПДРФ анализа, а генов PPAR, и LPL – методом ПЦР в режиме реального времени с TNF использованием конкурирующих TaqMan-зондов, комплементарных полиморфной последовательности ДНК.

Частоты встречаемости генотипов для всех исследуемых полиморфных локусов соответствовали закону Харди-Вайнберга, за исключением rs5443 гена GNB3 и rs328 гена LPL в группе больных метаболическим синдромом.

Нами не было выявлено статистически значимых различий частоты встречаемости аллелей или генотипов полиморфных локусов исследуемых генов между контрольной группой и группой больных метаболическим синдромом.

Существенно отметить, что литературные данные о влиянии этих полиморфных локусов на развитие ожирения и метаболического синдрома противоречивы. Возможно, это связано с комплексностью патогенеза заболевания, значительный вклад в который вносит и окружающая среда.

Весьма вероятно, что степень выраженности влияния данных полиморфных локусов на предрасположенность к развитию метаболического синдрома зависит от таких внешних факторов, как образ жизни, прежде всего калорийность пищи и наличие физической нагрузки.

Научный руководитель – д-р мед. наук Г. И. Лифшиц.

РАЗРАБОТКА МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР-СИСТЕМЫ ДЛЯ

ДЕТЕКЦИИ РЯДА МАЛОИЗУЧЕННЫХ ВИРУСОВ,

ВЫЗЫВАЮЩИХ ОСТРЫЕ ГАСТРОЭНТЕРИТЫ

–  –  –

Острые гастроэнтериты (ОГ) занимают второе место по распространенности среди инфекционных заболеваний. Значительную долю заболеваний этой группы (по некоторым оценкам, от 30 до 70%) составляют кишечные инфекции неуточненной этиологии (КИНЭ), поскольку в клинической практике, как правило, проводится детекция лишь небольшого спектра возбудителей ОГ: бактериальных патогенов, ротавирусов группы А и норовирусов.

С целью увеличения количества детектируемых вирусов – возбудителей ОГ нами была разработана новая мультиплексная ПЦРсистема с электрофоретической детекцией продуктов амплификации для лабораторной диагностики астровирусов, ротавирусов группы С и бокавирусов. Тест-система была проверена на предварительно охарактеризованной панели из 65 клинических образцов, содержащей астровирусы, ротавирусы С, ротавирусы А, норовирусы, аденовирусы и бактериальные возбудители ОГ. Показано, что специфичность системы при детекции ротавирусов С и астровирусов составила 100%.

Чувствительность тест-системы при определении астровирусов составила 100%. Все образцы, содержащие ротавирус С, также были корректно определены. Детекция бокавирусов в России ранее не проводилась, поэтому в панели отсутствовали пробы, охарактеризованные на наличие бокавирусов. С помощью созданной тест-системы были выявлены клинические образцы, содержащие бокавирус. Для подтверждения специфичности тест-системы было проведено определение нуклеотидных последовательностей полученных продуктов амплификации (включая ПЦР-фрагменты бокавирусов) и их сравнительный анализ с использованием базы данных GenBank (NCBI, США). Нуклеотидные последовательности амплифицированных фрагментов были зарегистрированы в GenBank. Ранее в GenBank не было зарегистрировано нуклеотидных последовательностей бокавирусов, детектированных в России.

Использование разработанной мультиплексной ПЦР-системы позволит расширить спектр методик для расшифровки этиологии острых гастроэнтеритов и уменьшить долю кишечных инфекций неуточненной этиологии.

Научный руководитель – д-р биол. наук Н. В. Тикунова.

АБЕРРАНТНО МЕТИЛИРОВАННЫЕ ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ ДНК

ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ КЛЕТОК В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК

ЧЕЛОВЕКА: СТАБИЛЬНОСТЬ, СВЯЗЫВАНИЕ С КЛЕТКАМИ И

ВЛИЯНИЕ НА МЕТИЛИРОВАНИЕ ДНК

–  –  –

Аберрантно метилированные ДНК, генерируемые клетками опухолей и циркулирующие в крови, представляют потенциальную биологическую опасность. Целью работы является изучение трансформирующего действия таких ДНК. Для этого мы исследовали стабильность метилированных внеклеточных ДНК (мет-внДНК), их транспорт в первичные клетки и влияние на метилирование ДНК первичных эндотелиоцитов (HUVEC) и фибробластов (HGF) человека. В качестве мет-внДНК были использованы ДНК из супернатанта клеток HeLa. В качестве ДНК-мишени был выбран фрагмент гена опухолевой супрессии RAR 2 (Genbank X56849: 924–1117), содержащий 13 потенциальных сайтов метилирования.

Для измерения концентрации различных форм гена была разработана количественная метилспецифичная SYBR Green I ПЦР (МС-ПЦР) для определения метилированной формы (чувствительность 28 копий, коэффициент вариации 10%) и общего количества гена RAR 2 (чувствительность 25 копий, коэффициент вариации 11%) после химической конверсии ДНК образца.

Для определения метилирования отдельных СpG сайтов были разработаны праймеры для амплификации ДНК фрагмента, секвенирующие праймеры, отработаны условия пиросеквенирования и определены аналитические характеристики метода:

минимальный уровень детекции метилирования цитозинов составляет 2,5%, коэффициент вариации составляет 3,5%.

По данным МС-ПЦР геномная и внДНК HeLa метилированы по всем CpG сайтам, геномная и внДНК HGF неметилирована, средний уровень метилирования геномной и внДНК HUVEC составляет 7%. По данным пиросеквенирования и МС-ПЦР мет-внДНК в составе нативных нуклеопротеиновых комплексов стабильна в культуральной среде первичных клеток в течение 8 часов. Такие комплексы связываются с поверхностью первичных клеток, а мет-вн ДНК на поверхности клеток не деградирует в течение как минимум 48 часов. Получены данные о транспорте мет-внДНК в клетки и влиянии на метилирование геномной ДНК первичных клеток.

Научные руководители – канд. биол. наук П. П. Лактионов, Т. Э. Скворцова.

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МЕТОДОВ

ДЕТЕКЦИИ ПРОДУКТОВ АМПЛИФИКАЦИИ ДНК НЕКОТОРЫХ

ВИРУСНЫХ АГЕНТОВ

–  –  –

В связи с ростом во всем мире заболеваний, вызываемых инфекциями, передаваемыми половым путем, и высокой социальной значимостью данной проблемы, в последнее время резко возросла роль современных методов лабораторного контроля. К методам современной диагностики относится ПЦР. С целью сравнения чувствительности различных методов детекции продуктов амплификации фрагментов ДНК вирусных агентов, вызывающих различные заболевания, в настоящей работе проведен сравнительный анализ методов электрофореза и флуоресцентной детекции.

В работе исследовали 200 образцов. Материалом исследования являлись плазма крови, мазки и соскобы.

С полученными образцами ДНК ставили реакции ПЦР для обнаружения ДНК следующих вирусов: цитомегаловируса, вируса герпеса I и II типов, вируса папилломы человека. Применяли внутренний, отрицательный и положительный контрольные образцы.

При исследовании образцов на предмет выявления в них вируса простого герпеса в двух случаях из 36 ДНК выявлялась при определении с помощью метода флуоресцентной детекции (5,5%). В четырех образцах из 65 наблюдали расхождение результатов при определении вируса папилломы человека высокого канцерогенного риска (6,1%). При этом в двух из них ДНК вируса определялась методом электрофореза при отрицательном флуоресцентном анализе, в то время как в других двух случаях картина была противоположной. Для определения ДНК цитомегаловируса проанализировали 73 образца. В двух пробах (2,7%) при детекции продуктов амплификации результаты не совпадали.

Полученные результаты позволяют сделать вывод об одинаковой чувствительности и достоверности обоих методов детекции продуктов амплификации: как электрофореза, так и флуоресцентного анализа.

Однако наблюдаемое несовпадение некоторых анализов предполагает проведение регулярного контроля и сравнения результатов различными методами детекции.

Научный руководитель – канд. биол. наук, доцент Г. П. Погосян.

РЕГУЛЯЦИЯ МОРФОГЕНЕЗА ПРОРОСТКОВ

ARABIDOPSIS THALIANA (L.) HEYNH С ИЗМЕНЕННЫМ УРОВНЕМ

БРАССИНОСТЕРОИДОВ СЕЛЕКТИВНЫМ СВЕТОМ

–  –  –

Брассиностероиды благодаря способности оказывать существенное влияние на рост, развитие и продуктивность растений в очень низких концентрациях привлекают повышенное внимание исследователей. В последнее время появилась информация о способности брассиностероидов инициировать реакции фотоморфогенеза в темноте. Обычно программа фотоморфогенеза осуществляется с помощью фоторецепторов, активируемых светом определенного спектрального состава. Ключевым звеном любого сигнального каскада являются вторичные посредники, определяющие конечный физиологический ответ. Возможно, брассиностероиды не только инициируют реакции фотоморфогенеза в отсутствие света, но и включаются в передачу светового сигнала.

Исследования проводили на 7-дневных проростках A. thaliana с нормальным и пониженным уровнем брассиностероидов – родительской линии экотипа Columbia (Col) и мутанта с нарушенным синтезом брассиностероидов (det2), соответственно.

При изучении морфогенеза 7-дневных проростков A. thaliana в темноте было показано, что нарушение синтеза брассиностероидов приводит к существенным изменениям программы развития проростков, что сопровождается ингибированием роста осевых органов и стимуляцией растяжения семядолей. По фенотипическим признакам мутантные проростки напоминают растения, выращенные на свету. При освещении проростков (3 и 6 часов ежедневно) синим ( max = 430 нм) и зеленым (max = 545 нм) светом наблюдались различия ростовой реакции осевых органов дикого типа и мутанта. При освещении проростков A. thaliana наблюдалось укорочение или гипокотилей Col, или корней det2.

Наибольший эффект в отношении проростков дикого типа был достигнут на синем свету. Площадь семядолей увеличивалась вне зависимости от спектрального состава света и эндогенного уровня брассиностероидов.

Таким образом, судя по ростовой реакции осевых органов на свет, можно предположить, что брассиностероиды являются важным сигнальным посредником для реализации программы фотоморфогенеза.

Работа поддержана ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 годы (мероприятие 1.3.1) и РФФИ (09-04-90741-моб_ст).

Научный руководитель – канд. биол. наук М. В. Ефимова.

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДОВ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ЭКОЛОГИИ ДЛЯ

ПОИСКА И ИДЕНТИФИКАЦИИ МАГНИТОТАКТИЧЕСКИХ

БАКТЕРИЙ

–  –  –

Способность некоторых бактерий к магнитотаксису обусловлена наличием в их клетках магнетосом – наночастиц магнетита или сульфида железа, окруженных липопротеидной мембраной. Зрелые магнетосомы характеризуются видоспецифичностью формы и линейных параметров кристаллов магнетита. Наличие липопротеидной мембраны позволяет использовать бактериальные магнетосомы для широкого круга практических приложений, в частности, для создания биосенсоров, магнитной сепарации клеток, белков, нуклеиновых кислот и для диагностических целей [1]. В связи с перспективностью использования магнитотактических бактерий появилась необходимость поиска и идентификации микроорганизмов – источников магнетосом. Цель настоящего исследования заключается в выявлении новых видов магнитотактиков с помощью определения биологического разнообразия накопительных культур, полученных на основе магнитной сепарации. Для определения видового состава культур был выбран подход, основанный на оценке разнообразия генов 16S рРНК, представленных в суммарной ДНК изучаемого сообщества. Основным способом такой оценки является амплификация генов 16S рРНК с последующим клонированием, секвенированием и филогенетическим анализом каждого гена [2]. В ходе проделанной работы были исследованы накопительные культуры, полученные из прибрежного ила р. Ольховка, г. Кисловодск. По данным филогенетического анализа выявлена ранее не описанная бактерия, близкая к родам Dechlorospirillum и Magnetospirillum. С помощью трансмиссионной электронной микроскопии было показано наличие магнетосом внутри клеток исследуемых бактерий. Последовательность гена 16S рРНК новой магнитотактической бактерии была опубликована в базе данных GenBank (GU724731). Работа выполнена в рамках проекта РАН «Нанотехнология».

______________________________

1. Schuler D. Magnetoreception and Magnetosomes in Bacteria. – SpringerVerlag: Berlin Heidelberg, 2006.

2. Stachl D. A. Molecular Approaches for the Measurement of Density, Diversity and Phylogeny. – American Society for Microbiology, 1997.

Научный руководитель – канд. биол. наук Б. Б. Кузнецов.

ПРОЕКТИРОВАНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОГЕННЫХ СВОЙСТВ

СИНТЕТИЧЕСКИХ АНТИГЕНОВ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ

–  –  –

Биокинетические и биоинформационные модели, описывающие взаимодействие антигена с иммунной клеткой, позволяют оценить не только уровень специфичности взаимодействия лиганд–рецептор, но и потенциал иммуногенности биомолекулярной конструкции и ее отдельных эпитопов. Целью моделирования таких процессов является разработка новых вакцин или иммунотерапевтических препаратов адресной доставки и направленного действия, а так же компонентов диагностических тестсистем. Внедрение методов биоинформатики и биокинетикив в процесс проектирования иммунологически активных молекул, несущих заданные эпитопы, дало толчок к новому практическому направлению в молекулярной иммунологии – эпитопной технологии, которая позволяет создавать новые группы терапевтических и биологически активных веществ. Задачами нашего исследования является систематизация информации о структурно-функциональной организации молекулы фактора некроза опухоли (ФНО), проектирование искусственных антигенов, несущих эпитопы ФНО, и изучение их иммуногенных свойств с целью получения антител с заданной эпитопной специфичностью.

Метод парного и множественного выравнивания аминокислотных последовательностей молекулы ФНО совместно с методами предсказания вторичной структуры аминокислотной последовательности и данными рентгеноструктурного анализа были применены для проектирования Вклеточных и Т-клеточных эпитопов ФНО. Синтетические иммуногенные конструкции, содержащие пептидные эпитопы ФНО, были использованы для иммунизации животных. Полученные иммунные сыворотки использовали для изучения специфичности и иммуногенности моноэпитопных конструкций. Показана зависимость величины иммунной реакции на пептидный эпитоп от средней величины поверхностного электростатического заряда иммуногена и от аффинности связывания иммуногена с рецепторами В-лимфоцитов.

Научный руководитель – Е. А. Рыжиков.

МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ И ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ

АКТИВНОСТЬ НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ГЛИЦЕРРЕТОВОЙ

КИСЛОТЫ

–  –  –

Для решения проблемы лечения онкологических заболеваний необходимы новые подходы, обеспечивающие высокую избирательность и эффективность лечения, и поиск новых противоопухолевых препаратов. В последние годы в качестве потенциальных противоопухолевых препаратов все больший интерес вызывают производные тритерпеноидов, в частности, глицерретовой кислоты (ГЛК), в большом количестве содержащейся в корнях солодки.

В настоящей работе проведено исследование 17 соединений, полученных путем направленной химической модификации ГЛК. Было показано, что 5 из них проявляют токсический эффект в отношении раковых клеток человека in vitro в микромолярных концентрациях, что свидетельствует об их фармакологическом потенциале.

При изучении механизма действия наиболее активного из исследованных соединения СГ-43 установлено, что производные ГЛК вызывают гибель опухолевых клеток по пути индуцированного апоптоза.

In vivo показано, что при внутрибрюшинном введении препарата в дозе 10 мг/кг соединение СГ-43 увеличивает продолжительности жизни животных с асцитной формой опухоли LS на 24%. Внутривенное введение эмульсии СГ-43 с 10% раствором солюбилизатора Tween-80, использующегося для повышения растворимости соединения, в дозе 50 мг/кг животным с гепатокарциномой ГА-1 увеличивает продолжительность их жизни на 21%.

Установлено, что внутрибрюшинное введение СГ-43 в дозе 20 мг/кг мышам с асцитной формой аденокарциномы Эрлиха приводит к уменьшению количества опухолевых клеток в асцитной жидкости на 33% по сравнению с контролем.

На модели асцитной формы карциномы Кребс-2 ex vivo показано, что СГ-43 тормозит ее рост на 88% по сравнению с контролем. Сходный эффект подтверждается и в экспериментах in vivo. Внутрибрюшинные инъекции СГ-43 в дозе 50 мг/кг в 10% растворах солюбилизаторов Tweenи Cremophor-EL животным с карциномой Кребс-2 подавляют рост данной опухоли на 76% и 57%, соответственно.

Научный руководитель – канд. биол. наук Е. Б. Логашенко.

ИССЛЕДОВАНИЕ СПОСОБНОСТИ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК

АКТИВИРОВАТЬ АНТИГЕН-СПЕЦИФИЧЕСКИЕ

ЦИТОТОКСИЧЕСКИЕ ЛИМФОЦИТЫ

–  –  –

В терапии онкологических заболеваний широкое применение получили методы, основанные на активации иммунной системы с помощью дендритных клеток (ДК). Для стимуляции противоопухолевого иммунного ответа большое значение имеют опухолеспецифические антигены (АГ), которыми трансфицируют ДК. На сегодняшний день остается не до конца выясненным вопрос, в какой форме антиген будет наиболее предпочтителен для ДК, то есть в какой форме он будет эффективно экспрессироваться, процессироваться, и презентироваться ДК и вызывать активацию под действием таких ДК антиген-специфических цитотоксических лимфоцитов (ЦТЛ).

В работе исследовали способность дендритных клеток, нагруженных различными источниками антигенов, активировать антигенспецифические цитотоксические лимфоциты in vitro и in vivo. В качестве источника антигенов использовали мРНК гена MDR1 человека, кодирующего белок Р-гликопротеин, обуславливающий устойчивость опухолевых клеток к химиотерапии, суммарную РНК из клеток опухоли мышей RLS40, гиперэкспрессирующих Р-гликопротеин, а также лизат клеток опухоли мышей Кребс-2.

Показано, что эффективность ЦТЛ мыши, активированных in vitro под действием ДК, нагруженных источником множества АГ (суммарной РНК клеток RLS40), в 1,4 раза выше, чем эффективность ЦТЛ, активированных под действием ДК, нагруженных источником одного АГ (мРНК гена MDR1). Исследование активации ЦТЛ мыши in vivo под действием ДК, обработанных лизатом клеток опухоли Кребс-2, показало, что спленоциты, индуцированные под действием таких ДК, вызывают гибель клеток линии Кребс-2 в 1,5 раза более эффективно по сравнению со спленоцитами, индуцированными с помощью интактных ДК.

Исследование in vivo иммуногенности ДК мыши, трансфицированных лизатом опухоли Кребс-2, показало, что предварительная вакцинация мышей такими ДК приводит к торможению скорости роста опухоли Кребс-2 у животных в 2 раза относительно контроля.

Научный руководитель – канд. биол. наук Н. Л. Миронова.

ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ ПРОТЕИНАЗЫ PROTEUS MIRABILIS

О. А. Мовчан, О. В. Митрофанова, Н. М. Замалютдинова, Е. О. Михайлова Казанский государственный университет им. В. И. Ульянова-Ленина Условно патогенные энтеробактерии Proteus mirabilis зачастую становятся причиной различных гнойно-воспалительных процессов и, в частности, инфекции мочевыводящих путей больных с физиологическими нарушениями. обладают различными факторами P. mirabilis вирулентности, к которым относятся и внеклеточные протеиназы.

Например, показано, что внеклеточные протеиназы могут специфически расщеплять иммуноглобулины класса А, которые играют важную роль в местном иммунитете. Однако роль внутриклеточных протеиназ этих бактерий в патогенезе неизвестна.

Целью настоящей работы было исследование протеолитической активности во внутриклеточном экстракте P. mirabilis. В качестве субстратов для определения активности использовали азоказеин и актин, выделенный из ацетонового порошка мышц кролика. Исследовалась динамика роста бактерий и динамика появления активности по отношению к азоказеину и актину, а также чувствительность внутриклеточной протеолитической активности к различным ингибиторам.

Внутриклеточный экстракт получали из отмытых клеток методом замораживания–оттаивания. Активность по отношению к актину определяли электрофоретически. Исследование динамики роста бактерий показало, что на среде LB с аэрацией бактерии выходят на стационарную фазу роста на 9–10-й час культивирования. Поэтому для определения активности брали клетки в экспоненциальной фазе роста (8 ч.), ранней (16 ч.) и поздней стационарной фазах роста (24 и 48 ч.). Показано, что активность по азоказеину и актину появляется уже на 8-й час и присутствует в клетках на всех стадиях роста. Показано, что актин расщепляется ограниченно с образованием большого фрагмента с молекулярной массой 36 кДа. Ингибиторный анализ с использованием офенантролина – ингибитора металлопротеиназ и PMSF – ингибитора сериновых протеиназ показал, что основная протеолитическая активность в клеточном экстракте определяется металлопротеиназой (85% активности по азоказеину) и незначительная часть обусловлена сериновой протеиназой (15%). Расщепление актина с образованием 36-кДа фрагмента полностью подавляется о-фенантролином и не подавляется PMSF. Таким образом, во внутриклеточном экстракте обнаружены металлопротеиназы и сериновые протеиназы. Ограниченный протеолиз актина обусловлен действием металлопротеиназы.

Научный руководитель – канд. биол. наук, доцент А. М. Марданова.

ФОТОПРОТЕИН ОБЕЛИН КАК БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ

МАРКЕР ДЛЯ ФРАГМЕНТ-КОМПЛЕМЕНТАЦИОННОГО

АНАЛИЗА БЕЛОК-БЕЛКОВЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ

–  –  –

Исследование белок-белковых взаимодействий в живой клетке является одним из основных направлений современной протеомики.

Понять, как осуществляется поддержание жизни клетки, невозможно без идентификации всех взаимодействующих партнеров каждого белка, кодируемого геномом. Разработка методов, позволяющих регистрировать все эти взаимодействия в живой клетке, особенно в динамике, является очень актуальной задачей на сегодняшний день.

Одной из стратегий изучения белок-белковых взаимодействий в динамике является метод комплементации белковых фрагментов [1].

Принцип метода основан на свойстве белка-репортера восстанавливать свою активность при сборке из двух независимых фрагментов во время стерического сближения. По активности репортера можно судить о взаимодействии двух целевых белков, каждый из которых слит с отдельным фрагментом.

В качестве таких репортеров представляется очень перспективным использование биолюминесцентных белков, и, в частности, фотопротеина обелина из гидроида Obelia longissima [2].

В работе показано, что компактная глобулярная молекула обелина, формируемая двумя доменами из -спиралей в виде чашек, соединенных краями, позволяет разделить молекулу обелина на фрагменты, способные формировать нативную структуру фотопротеина из отдельно синтезируемых фрагментов. Продемонстрирована потенциальная пригодность полученных фрагментов Са2+-регулируемого фотопротеина обелина для разработки методов визуализации in vivo белок-белковых взаимодействий в модельном эксперименте на примере «лейцинового зиппера».

______________________________

1. Morell M., Ventura S. (2009) FEBS Lett., 583, p. 1684–1691.

2. Высоцкий Е. С. и др. (2006) Молекуляр. биология, 40, с. 404–417.

Научные руководители – канд. биол. наук С. В. Маркова, канд. биол.

наук Е. С. Высоцкий.

СОСТОЯНИЕ ГЛУТАТИОНОВОГО ЗВЕНА АНТИОКСИДАНТНОЙ

СИСТЕМЫ ЧЕЛОВЕКА ПРИ РАКЕ ПОЧКИ

–  –  –

На долю почечноклеточного рака (ПКР) приходится 90–97 % опухолей почек и 3,5 % всех злокачественных новообразований у взрослых.

Факторы риска развития ПКР включают курение, ожирение, профессиональную вредность, употребление некоторых лекарственных препаратов. Основным методом лечения остается хирургическое вмешательство. Известно, что про- и антиоксидантный статус организма является важным критерием оценки тяжести течения патологического процесса. Ведущую роль в антиоксидантной защите организма играют ферменты метаболизма глутатиона – глутатионпероксидаза (GPO) и глутатион-S-трансфераза (GST).

Целью исследования являлось изучение состояния глутатионового звена антиоксидантной системы в плазме и эритроцитах крови у больных ПКР до и после хирургического лечения в динамике.

На базе Красноярского краевого онкологического диспансера под динамическим наблюдением находились пациенты с местнораспространенным ПКР до операции, на первые и седьмые сутки после радикальной нефрэктомии (150 человек в возрасте от 50 до 70 лет).

Группу контроля составили 17 практически здоровых доноров. Состояние глутатионового звена оценивали по содержанию восстановленного глутатиона (GSH) и активности глутатионзависимых ферментов: GPO и GST.

Изучение состояния глутатионового звена антиоксидантной системы больных ПКР показало, что в период до хирургического лечения в плазме и в эритроцитах крови не наблюдается изменений вышеназванных показателей по сравнению с контролем. Первые сутки после операции характеризуются повышенной активностью GPO (относительно контроля р 0,05).На третьи и седьмые сутки наблюдается аналогичная картина, кроме того отмечен пониженный уровень GSH (в 2 раза по сравнению с контрольными величинами р 0,001).

Таким образом, результаты проведенного исследования свидетельствуют, что наибольший сдвиг в антиоксидантной системе приходится на период между третьими и седьмыми сутками после операции. Полученные нами данные позволяют рекомендовать применение наряду с традиционным лечением антиоксидантной терапии.

Научный руководитель – канд. биол. наук, доцент Н. М. Титова.

ИЗУЧЕНИЕ ТРАНСКРИПТОМА OPISTHORCHIS FELINEUS

ПУТЕМ СЕКВЕНИРОВАНИЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ

АННОТАЦИИ БИБЛИОТЕКИ ЕГО кДНК

–  –  –

В современной паразитологии изучение транскриптомов возбудителей заболеваний позволяет разрабатывать новые методы диагностики и фармакологические мишени, которые в дальнейшем могут быть использованы для создания эффективных лекарственных средств. С целью изучения транскрипционно активных генов паразита Opisthorchis felineus были выделены 11 тыс. клонов из обогащенной, ненормированной кДНКбиблиотеки с направленно клонированными вставками (Гусельников с соавт, неопубл. данные). Для секвенирования полученных кДНК были отработаны методики получения биомассы клонов в 96-луночных планшетах, их консервации, выделения плазмид, получения амплифицированных фрагментов с помощью роботизированных станций QiaCube и Tecan. Для снижения затрат были разработаны составы растворов, заменяющих входящие в коммерческие наборы, а также отработаны протоколы регенерации дорогостоящих наконечников, планшетов для очистки ДНК, и спин-колонок. В настоящий момент клоны секвенируются и ведется работа по аннотированию прочитанных последовательностей. На основании определенных к настоящему времени последовательностей 60 клонов из кДНК-библиотеки можно предположить, что в ней наиболее часто представлены мРНК пищеварительных белков (цистеиновые пептидазы, катепсины), ферменты II фазы инактивации ксенобиотиков (глутатион S-трансферазы), транспортные и мышечные белки.

Научный руководитель д-р биол. наук С. И. Татьков.

ВЛИЯНИЕ АЦЕТИЛСАЛИЦИЛОВОЙ КИСЛОТЫ НА

ФИБРИНОЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ КРОВИ У ПАЦИЕНТОВ

С ОСТРЫМ ИШЕМИЧЕСКИМ ИНСУЛЬТОМ

–  –  –

Материалы и методы: Обследованы 17 человек, поступивших на лечение в специализированный нейро-сосудистый центр с острым ишемическим инсультом. Диагноз ишемического инсульта был подтвержден компьютерной томографией. С момента поступления всем пациентам назначалась ацетилсалициловая кислота (АСК) в дозе 125 мг/сутки. Кровь на исследование забиралась из локтевой вены у всех пациентов спустя 4–5 суток после начала приема, а также пятерых пациентов при поступлении на лечение. Для исследования использовались образцы цельной цитрированной крови. Оценку фибринолитической активности крови производили на тромбоэластометре ROTEM (Германия).

Для оценки состояния фибринолиза у пациентов оценивали два параметра:

LI30 – тридцатиминутный лизис-индекс, характеризующий степень фибринолиза, имевшего место через 30 минут после времени формирования сгустков, и ML – максимальный лизис, который характеризует степень фибринолиза относительно достигнутого значения максимальной твердости сгустка. В качестве активатора были использованы реагенты EXTEM-анализа, вызывающие умеренную внутреннюю активацию гемостаза. Всем обследованным определяли также АДФ- и адреналининдуцированную агрегацию тромбоцитов. Измерение производилось на агрегометре Chrono log (США) с использованием богатой тромбоцитами плазмы пациентов. Контролем служили образцы крови, полученные от практически здоровых пациентов. Статистическую обработку данных осуществляли с использованием пакета программ Microsoft Office Excel 2007.

Результаты: Рассмотренные показатели фибринолиза у здоровых людей и пациентов с ишемическим инсультом существенно не отличаются. Группу больных, принимавших АСК, можно поделить на две подгруппы: пациенты без изменения фибринолитической активности крови (29,4 % от числа всех обследованных) и пациенты с повышенными показателями фибринолиза (70,6 %). В последней подгруппе фибринолитическая активность крови повысилась на 31,7 % (LI30) и на 83,3 % (ML) по отношению к контролю (таблица 1). Также была оценена связь между агрегационной активностью тромбоцитов и показателями фибринолиза (таблица 2). В обеих группах, принимавших аспирин, значения агрегационной активности были ниже по сравнению с контролем (на 14 % при АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов и на 45 % при адреналининдуцированной агрегации). У всех пациентов, принимавших аспирин, наблюдалось снижение АДФ-индуцированной агрегации на 17 %, адреналининдуцированной агрегации на 71 % в группе с нормальными показателями фибринолитической активности крови и на 46,6 % в подгруппе с высокими показателями фибринолиза по сравнению с контрольными значениями.

–  –  –

Артериальная гипертензия является мультифакториальным заболеванием, развивающимся на фоне наследственной предрасположенности. Для изучения генетического контроля развития гипертонии, в ИЦиГ СО РАН была создана линия крыс с наследуемой стресс-индуцируемой артериальной гипертензией (линия НИСАГ). Ранее проведенный в лаборатории эволюционной генетики ИЦиГ СО РАН анализ микрочипов (Illumina, USA) показал достоверные различия в уровне экспрессии гена катехол-О-метилтрансферазы (COMT) у гипертензивных крыс НИСАГ и нормотензивных крыс WAG. Белок COMT участвует в катаболизме катехоламинов. Наибольшая его активность наблюдается в печени и почках [1]. В почках ген COMT экспрессируется в эпителиальных клетках проксимальных трубочек. По результатам микрочипов экспрессия гена COMT в почках была достоверно (в 10 раз) снижена у крыс НИСАГ по сравнению с крысами WAG.

Для подтверждения данных микрочипов проводили сравнительный анализ экспрессии гена COMT методом полимеразной цепной реакции в реальном времени. Результаты подтвердили наличие межлинейных различий в уровне экспрессии гена COMT у крыс НИСАГ и WAG, что хорошо согласуется с данными литературы.

Концентрация COMT у гипертензивных крыс линии SHR в печени и у крыс линии Dalh (S) при высокосолевой диете снижены по сравнению с крысами контрольных линий. Снижение метилирования катехоламинов может оказывать влияние на уровень артериального давления [1].

Возможно, изменение уровня экспрессии гена COMT играет роль в формировании гипертензивного статуса у крыс линии НИСАГ, что позволяет рассматривать его как ген-кандидат, перспективный для дальнейшего изучения.

Работа поддержана грантами РФФИ № 08-04-01048 и Министерства науки и образования РФ № 3H-319-09.

______________________________

1. Mnnist P, Kaakkola S. (1999) Pharmacol. Rev., 51, p. 593–628.

Научный руководитель – канд. биол. наук O. E. Редина.

ОЧИСТКА ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ПРОТЕИНАЗ ИЗ BACILLUS SUBTILIS

СКБ 256 БИОСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ

–  –  –

Разработан простой и эффективный метод очистки внеклеточных протеиназ из бактерий Bacillus subtilis СКБ 256 путем биоспецифической хроматографии на сорсилене, импрегнированном гемоглобином или цитохромом c. Изучено влияние рН среды, ионной силы и содержания этанола на процесс очистки внеклеточной протеиназы. Показано, что добавление этанола повышает эффективность очистки протеиназы, предотвращая гидролиз белков.

В настоящее время разработаны различные способы выделения и очистки различных протеиназ, включая методы биоспецифической хроматографии. В качестве лигандов для биоспецифической хроматографии успешно используется как низкомолекулярные, так и высокомолекулярные соединения, имеющие сродство к протеиназам.

Протеиназы имеют достаточно высокое сродство к белковым субстратам типа гемоглобина или цитохрома c. Прочность связывания с ними значительно выше, чем с другими субстратами или синтетическими пептидами (хотя каталитическая стадия может протекать медленнее).

Поэтому мы предположили, что на основе этих субстратов можно попытаться создать биоспецифические сорбенты, используя пористые носители, импрегнированные белками.

После предварительного испытания ряда сорбентов (полиамиды, базальтовые волокна, неорганические полимеры, фильтрующие материалы типа Millipore и др.) был выбран синтетический сорбент сорсилен, представляющий собой сополимер терефталевой кислоты и этиленгликоля.

Установлено, что адсорбированный гемоглобин и цитохром c при их инкубации в растворах, содержащих протеиназы, подвергаются ферментативному гидролизу. Было также установлено, что этанол при его концентрации в среде свыше 20% замедляет этот процесс, при этом ферментативный процесс практически не протекает, хотя присутствие этанола мало влияет на связывание фермента с гемоглобином. Также изучено влияние рН среды и ионной силы на процесс очистки протеиназ.

ШИРОКОСПЕЦИФИЧНЫЙ И ВЫСОКОАКТИВНЫЙ ПРЕПАРАТ

ПРОТЕИНАЗЫ НА ОСНОВЕ BACILLUS SUBTILIS СКБ 256

–  –  –

В последние годы для переработки отходов сельского хозяйства, а также в пищевой и зерноперерабатывающей промышленности для приготовления кормовых добавок и комбикорма широко применяются высокоактивные препараты из микроорганизмов.

С целью создания широкоспецифичного и высокоактивного препарата протеиназы на основе спорообразующих бактерий Bacillus subtilis СКБ 256. Подобран оптимальный состав питательной среды и условия роста и развития этой бактерии. Показано что Bacillus subtilis СКБ 256 синтезирует множественные молекулярные формы протеиназ, отличающиеся по внутриклеточной локализации, субстратной специфичности, молекулярной массе и другим физико-химическим свойствам.

Разработана единая схема очистки внутриклеточных, связанных с клеточной мембраной и внеклеточных протеиназ Bacillus subtilis СКБ 256.

Для этих целей синтезированы биоспецифические сорбенты на основе силохрома, импрегнированного гемоглобином и цитохромом c, проведен сравнительный анализ различных форм протеолитических ферментов, синтезируемых этой бактерией, а также изучены некоторые свойства и места локализации отдельных форм фермента. Выявлено, что качественный состав протеиназ независимо от условий культивирования и состава питательной среды включает внутриклеточные, связанные с мембраной и внеклеточные ферменты. Высказано предположение о возможном родстве внутриклеточных форм фермента с внеклеточными формами протеиназ.

Разработан лабораторный регламент получения комплексного препарата протеиназы, который включает следующие этапы:

культивирование штамма до стадии спороношения, концентрирование и гомогенизация (автолиз), экстракция внутриклеточных протеиназ, осаждение фермента изопропанолом, сушка и стабилизация по протеолитической активности.

ПОЛУЧЕНИЕ МОДИФИЦИРОВАННОГО ФЕРМЕНТА

КСИЛОЗОИЗОМЕРАЗЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТЕХНИКИ

НАПРАВЛЕННОГО МУТАГЕНЕЗА

–  –  –

В мире широко используется технология переработки крахмала (главным образом, кукурузного) на сахаристые продукты, в том числе и ГФС (глюкозо-фруктозный сироп). Данная технология основана на применении ферментативного гидролиза крахмала до глюкозы, которая далее ферментативно изомеризуется во фруктозу. Отечественная промышленность производит ферменты для гидролиза крахмала, однако фермент для последней стадии – изомеризации – в России не производится, главным образом по причине отсутствия продуцента.

Приобретение продуцента ксилозоизомеразы по импорту повышает стоимость конечного продукта настолько, что процесс становится экономически невыгодным. В связи с этими обстоятельствами для создания производства глюкозо-фруктозных сиропов необходим собственный отечественный продуцент, чтобы избежать зависимости от зарубежных компаний, являющихся собственниками существующих промышленных штаммов.

Коллективом авторов был клонирован и исследован ген ксилозоизомеразы Escherichia coli [1]. Этот фермент оказался недостаточно стабилен. В ходе работы была сделана попытка изменения свойств фермента с помощью образования дисульфидной связи на C-конце между двумя субъединицами. В результате был получен модифицированный фермент, содержащий дисульфидную связь, предсказанную в ходе моделирования. Образование данной связи было показано с помощью электрофореза в денатурирующих условиях.

Каталитические свойства полученного фермента оказались на уровне исходного, стабильность повысилась незначительно.

______________________________

1. Розанов А.С. и др. (2009) Прикладн. биохимия и микробиология, 45, с. 38–44 Научный руководитель – д-р биол. наук, проф. С. Н. Загребельный.

КАТАЛИТИЧЕСКАЯ ПОЛИСПЕЦИФИЧНОСТЬ АБЗИМОВ

МОЛОКА ЧЕЛОВЕКА

–  –  –

Конформационная пластичность антигенсвязывающих участков антител является одним из общепринятых путей объяснения феномена полиспецифичности моноклональных и природных антител. Активные центры молекул моноклональных антител под действием некоторых из связываемых лигандов могут эффективно изменять конформацию антигенсвязывающего домена, подстраиваясь под структуру связываемого лиганда.

В данной работе была впервые исследована природа полиспецифичности абзимов – каталитически активных антител.

Электрофоретически гомогенные IgG и sIgA молока человека были разделены аффинной хроматографией по сродству к ДНК. Полученные фракции IgG и sIgA обладали ферментативными активностями в реакциях гидролиза ДНК, АТР, олигосахарида, а также фосфорилирования липидов и олигосахаридов, прочно связанных с антителами. Аналогичная ситуация наблюдалась при последующей хроматографии sIgA и IgG, имеющих сродство к ДНК, на АТР-сефарозе. При этом наблюдалось полное или частичное перекрывание пиков, соответствующих различным исследованным активностям.

Высокое сродство некоторых субфракций IgG и sIgA к аффинным сорбентам, обладающих несколькими каталитическими активностями может указывать на то, что молекулы sIgA и IgG могут содержать антигенсвязывающие центры к различным антигенам.

Таким образом, возможным механизмом происхождения каталитической полиспецифичности абзимов молока человека, может быть обмен «плечами» их Fab, доказанный ранее для IgG четвертого подкласса крови человека, легкими цепями или, в случае sIgA, образования химерных молекул из мономеров IgA с различными активными центрами.

Работа поддержана Аналитической ведомственной целевой программой «Развитие научного потенциала высшей школы» 2.1.1/5580.

Научный руководитель – д-р хим. наук, проф. Г. А. Невинский.

РОЛЬ БЕЛКА gp130 В МОЛЕКУЛЯРНОМ МЕХАНИЗМЕ

ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К ЛИПОПОЛИСАХАРИДУ У МЫШЕЙ

–  –  –

Липополисахарид (ЛПС) – эндотоксин внешней оболочки грамотрицательных бактерий – вызывает болезненное состояние и депрессивное поведение. ЛПС является индуктором воспаления и активирует экспрессию провоспалительных цитокинов IL-1, TNF и IL-6.

IL-6 играет важную роль в регуляции пластичности нервной системы через активацию экспрессии таких специфических белков, как глиальный белок GFAP.

Рецептор IL-6 состоит из двух субъединиц:

лигандсвязывающей субъединицы IL-6R и сигнального трансдуктора gp130, который запускает сигнальный каскад JAK-STAT.

В лаборатории нейрогеномики поведения ИЦиГ СО РАН создана уникальная конгенная линия мышей AKR.CBA-D13Mit76BC, в которой ген, кодирующий белок gp130, был перенесен из линии CBA/LacJ в геном линии AKR/J.

Целью данной работы являлось выяснение роли белка gp130 в генетико-молекулярном механизме действия ЛПС. Для этого изучали эффект ЛПС (50 мкг/кг, в/б) на двигательную активность и экспрессию генов, кодирующих белки gp130 и GFAP, в коре, гиппокампе и среднем мозге половозрелых самцов AKR/J и AKR.CBA-D13Mit76BC.

Контрольным животным вводили физиологический раствор. Уровень мРНК оценивали методом количественной ОТ-ПЦР.

ЛПС не влиял на двигательную активность мышей линии AKR, но значительно снижал ее у животных линии AKR.CBA-D13Mit76BC. В исследованных структурах мозга не выявлено различие по уровню мРНК гена, кодирующего gp130, между животными линий AKR/J и AKR.CBAD13Mit76BC. ЛПС также не влиял на экспрессию этого гена. Введение эндотоксина не изменило экспрессию гена, кодирующего белок GFAP у животных AKR. В то же время ЛПС существенно увеличивал экспрессию белка GFAP в среднем мозге у мышей линии AKR.CBA-D13Mit76BC.

Таким образом, белок gp130 вовлечен в механизм чувствительности к ЛПС. Мыши линии AKR.CBA-D13Mit76BC более чувствительны к ЛПС, чем животные линии AKR/J. Эта повышенная чувствительность, повидимому, обусловлена наследственным изменением структуры белка gp130, а не регуляцией уровня его экспрессии.

Научный руководитель – д-р биол. наук А. В. Куликов.

ИССЛЕДОВАНИЕ КРАТКОВРЕМЕННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ

ЭЛЕКТРОМАГНИТНОГО ПОЛЯ НА АНТИОКСИДАНТНУЮ

СИСТЕМУ ТКАНЕЙ КРЫС

Е. Ю. Смирнова, Ю. В. Фоминых Сибирский федеральный университет, г. Красноярск Электромагнитные поля (ЭМП) – это особая форма существования материи, характеризующаяся совокупностью электрических и магнитных свойств. С начала 90-х годов ХХ века произошли изменения в структуре источников ЭМП, связанные с возникновением их новых видов (сотовой и других видов персональной и мобильной коммуникации), освоением новых частотных диапазонов и т.п.

Существуют свидетельства о биологической активности ЭМП. Степень биологического воздействия на организм человека зависит от их характеристик. Одним из эффектов воздействия ЭМП на биологические объекты является избыточное образование активных форм кислорода (АФК) и активация свободнорадикальных процессов. В небольшом количестве АФК необходимы организму, но при повышении их концентрации наступает окислительный стресс, интенсивность которого определяется соотношением прооксидантных (ПОС) и антиоксидантных систем (АОС). Механизм нарушения стационарного соотношения ПОС/АОС при воздействии ЭМП изучен недостаточно.

Цель. Исследовать изменения показателей антиоксидантной системы в тканях при кратковременном воздействии слабого электромагнитного поля персонального компьютера.

Материалы и методы. Объектом служили гомогенаты тканей (печени, почек и селезенки) беспородных белых крыс массой 150–180 г. Опытные образцы гомогенатов подвергали воздействию ЭМП в течение 5 мин in vitro. Источником ЭМП был персональный компьютер с цветным монитором (1,96 мкТл, 72 В/м, 2,53 кВ/м). Исследовалась активность антиоксидантных ферментов: супероксиддисмутазы (СОД), каталазы, глутатионпероксидазы (ГПО), глутатион-S-трансферазы (ГST);

содержание восстановленного глутатиона (ГSH); интенсивность прооксидантных процессов оценивалась по содержанию малонового диальдегида (МДА).

Результаты. Во всех тканях отмечалось резкое повышение уровня МДА, особенно в печени и почках, на фоне угнетения активности ферментов АОС. Во всех тканях наблюдали достоверное снижение активности каталазы и СОД (в среднем на 90–96%). В почках уменьшалась концентрация ГSН на 76%, в печени и селезенке снижение не достоверно.

Активность ГПО в печени при облучении возросла на 143% (р 0,05), в почках и селезенке – уменьшилась на 61% (р 0,05) и 30% соответственно. Активность ГSТ достоверно снижалась на 40% по сравнению с контролем в почках и в печени; в селезенке – повышалась.

Вывод. Кратковременное воздействие ЭМП на ткани in vitro приводит к интенсификации ПОЛ на фоне разнонаправленного изменения активности АОС.

Научный руководитель – канд. биол. наук, проф. Н. М. Титова.

ОЦЕНКА ВРЕМЕНИ ДИЗЪЮНКЦИИ АРЕАЛА EVERSMANNIA

EXORNATA (INSECTA: LEPIDOPTERA) С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ

ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ ГЕНА ГИСТОНА H1.

В. И. Соловьев Институт цитологии и генетики СО РАН Новосибирский государственный университет Эверсманния украшенная (Eversmannia exornata) из семейства Epiplemidae имеет восточноевропейско-западносибирско-дальневосточный дизъюнктивный ареал. Традиционно подобные дизъюнктивные ареалы объясняли плейстоценовым оледенением, которое привело к фрагментации единого ареала, существовавшего в плиоцене не менее 1,5 млн. лет назад. Привлечение палеопалинологического материала и реконструкция растительного покрова в Евразии позволило В. В. Дубатолову и О. Э. Костерину высказать предположение о гораздо более поздней, голоценовой датировке дизъюнкции ареалов неморальных видов чешуекрылых в Северной Азии [1]: такие виды распространялись с востока на запад около 5 тыс. лет назад во время климатического оптимума голоцена, в ходе последовавшего небольшого похолодания ареал оказался фрагментированным.

В данной работе делается попытка оценить время дизъюнкции ареала неморального вида Eversmannia exornata на основе изменчивости первичной структуры гена гистона H1 в трех изолированных частях ареала. Гистон H1 проявляет достаточную вариабельность, вплоть до внутривидового полиморфизма у некоторых организмов.

Нуклеотидная последовательность гена гистона была H1 проанализирована у 16 особей E. exornata из Тульской, Новосибирской и Еврейской автономной области. Она оказалась идентичной за исключением одной синонимичной нуклеотидной замены, что говорит в пользу очень недавней дивергенции популяций. Оба синонимичных варианта гена гистона H1 присутствуют в каждой из трех частей ареала E. exornata. Таким образом, они унаследовали общий нейтральный полиморфизм по данной позиции, а следовательно, не проходили через этапы резкого снижения численности популяций, что свидетельствует в пользу гипотезы о недавней дизъюнкции ареала E. exornata.

______________________________

1. Dubatolov V. V., Kosterin O. E. (2000) Entomol. Fennica, 11, p. 141–166.

Научный руководитель – канд. биол. наук, О. Э. Костерин.

ЭВОЛЮЦИОННЫЕ ВЗАИМООТНОШЕНИЯ ДНК

ТРАНСПОЗОНОВ СУПЕРСЕМЕЙСТВА ТC1-MARINER У

ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ОТРЯДА LEPIDOPTERA

–  –  –

Мобильные генетические элементы способны менять свою локализацию в геноме и играют важную роль в организации, функционировании и эволюции генома. Представители суперсемейства Tc1-mariner – самые распространенные и разнообразные элементы класса ДНК-транспозонов. На данный момент в суперсемействе Tc1-mariner описано 7 групп элементов: mauritiana, cecropia, mellifera, irritans, capitata, elegans и mori. Элементы mariner могут переноситься горизонтально между репродуктивно изолированными видами.

Для изучения эволюционных взаимоотношений элементов mariner нами было проведено исследование представителей данного суперсемейства в геномах различных видов отряда Lepidoptera. Для построения базового филогенетического дерева и подбора праймеров были использованы известные нуклеотидные последовательности элементов mariner из генома Bombyx mori. С помощью ПЦР-амплификации был осуществлен поиск элементов mariner в геномах представителей 19 видов отряда Lepidoptera. Полученные фрагменты были клонированы в векторе pGEM. В результате анализа последовательностей были отобраны 145 клонов, содержащих фрагмент транспозазы. Полученные последовательности были использованы в филогенетическом анализе совместно с последовательностями, полученными из геномных баз данных. Анализ филогенетических деревьев показал присутствие в геномах представителей отряда Lepidoptera элементов mariner 3 групп суперсемейства Tc1-mariner: mauritiana, cecropia и mellifera.

Научный руководитель – канд. биол. наук А. Г. Блинов.

ПРОГРАММИРУЕМАЯ ГИБЕЛЬ КЛЕТКИ.

РОЛЬ В НОРМЕ И ПРИ ПАТОЛОГИИ

–  –  –

Программируемая гибель клетки (ПГК) в настоящее время интенсивно изучается, поскольку имеет важное значение для понимания природы различных тяжелых заболеваний. Онкологические заболевания стоят на втором месте по смертности в мире. Также интенсивно растет число больных болезнью Альцгеймера (БА) и синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД), основанных на процессах ПГК. Поэтому целью данного обзора являлось изложение в наиболее доступной для студентов форме процессов, связанных с ПГК при патологических изменениях в организме.

Реализация ПГК – это естественный процесс организма, который обуславливает поддержание относительно постоянного количества клеток в организме. Этот процесс делится на 2 типа: некроз и апоптоз.

Некроз (от греч. r – мртвый) – способ ПГК, при котором клетка наиболее быстро разрушается. Показано, что при некрозе реализуются те же механизмы, что при апоптозе, но имеется ряд отличий.

Апоптоз – это наиболее часто встречающийся вид ПГК, который характеризуется запуском ряда биохимических реакций, опосредованных повреждающим воздействием на митохондрии, хроматин, и в конечном счете ядро.

Таким образом, реализация ПГК имеет не только важное физиологическое значение для организма, но и участвует в развитии патологических состояний. Однако в результате нарушения процессов реализации ПГК могут возникать такие опасные заболевания, как БА, СПИД, онкология. Важно, что отклонение ПГК от нормы происходят как в сторону усиления, так и в сторону подавления.

К патологическим процессам, обусловленным усилением апоптоза, относятся БА и СПИД. При БА наблюдается массированная апоптотическая гибель нейронов, что приводит к нарушению механизмов памяти. Большую группу заболеваний, обусловленных подавлением апоптоза, образуют злокачественные опухоли. Важную роль в этом процессе играют мутации гена белка Р53 и ограничение его синтеза.

Поэтому в своей работе мы рассматриваем проблемы связанные с механизмами нарушений реализации ПГК, решение которых может помочь в лечении наиболее тяжелых болезней современности.

Научный руководитель – д-р биол. наук А. Г. Жукова.

АССОЦИАЦИЯ 54-НУКЛЕОТИДНОГО ТАНДЕМНОГО ПОВТОРА

В ГЕНЕ hPER3 С ГЕРОИНОВОЙ ЗАВИСИМОСТЬЮ У ЖИТЕЛЕЙ

ЗАПАДНО-СИБИРСКОГО РЕГИОНА

–  –  –

Героиновая зависимость – заболевание, характеризующееся формированием психической и физической зависимости от приема героина. Патологическое влечение к наркотику возникает уже к 3–5-му приему. По оценкам на конец 2002 года в России состояли на учете 323 000 человек.

В результате исследования семейных случаев наркотической зависимости, анализа усыновленных детей и близнецового анализа был сделан вывод, что наркотическая зависимость – это вид болезни, связанный не только с факторами окружающей среды, но и с генетическими факторами.

Изучение взрослых наркотически зависимых пациентов показало, что использование психоактивных веществ связано с нарушениями сна.

Исследования последних лет показали, что гены суточного цикла (гены групп PER, CLOCK, BMAL1, CRY) влияют на становление наркотической зависимости.

Целью данной работы является исследование роли тандемного повтора экзона 18 гена hPER3 в генетической предрасположенности к героиновой зависимости у жителей Западно-Сибирского региона. Частоты встречаемости аллелей локуса hPER3 были определены у людей, страдающих героиновой зависимостью, а также в контрольной группе.

Частоты встречаемости аллелей удовлетворяли закону Харди-Вайнберга.

Согласно полученным нами данным носительство аллеля с 4 тандемными повторами является протективным фактором по сравнению с 5 тандемными повторами (OR = 0,506, C.I. = [0.29–0.9], p = 0.018). Эти результаты позволяют предположить, что полиморфизм локуса hPER3 ассоциирован с героиновой зависимостью и является потенциальным фактором риска для ее развития.

Научные руководители – канд. биол. наук М. Л. Филипенко, Е. А. Кудрявцева.

ИССЛЕДОВАНИЕ СПОСОБНОСТИ К АГРЕГАЦИИ

ПОКСВИРУСНЫХ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИХ БЕЛКОВ

–  –  –

Представители рода Ortopoxvirus включают в себя такие патогенные для человека виды, как вирус натуральной оспы (ВНО), вирус оспы коров (ВОК), вирус оспы обезьян (ВОО). В их геноме закодировано большое число белков-иммуномодуляторов, в том числе белков, способных связывать гамма-интерферон (gИФН) и фактор некроза опухолей (ФНО).

Наличие таких белков позволяет вирусу эффективно уклоняться от защитных систем поражаемого организма.

При исследовании gИФН-связывающего белка (gИФН-СБ) ВНО и ВОО с помощью гель-фильтрации, конкурентного иммуноферментного анализа и Вестерн-блот анализа нами впервые было показано, что gИФН-СБ представляет собой преимущественно тетрамеры. Повторная гельфильтрация фракции, содержащей тетрамер gИФН-СБ, показала, что данный белок проявляет склонность к агрегации, образуя комплексы массой больше 500 кДа.

Для еще одной группы вирусных иммуномодуляторов – Crm-белков (cytokine response modifier) связывающих ФНО, хемокины, человеческий лимфотоксин, ранее была показана способность к мультимеризации: CrmB ВНО образует олигомерные формы, CrmB ВОК – димерные. Причины показанных отличий на настоящий момент не установлены. Нами впервые проводится работа по установлению участия доменов белка CrmB в процессе олигомеризации. У белка CrmB выделяют SECRET-домен, связывающий хемокины и домен, связывающий ФНО. Кроме того, в ФНОсвязывающем домене выделяют PLAD-домен, предположительно участвующий в процессе олигомеризации. Нами были получены химерные и укороченные варианты белков CrmB ВНО и CrmB ВОК в бакуловирусной системе экспрессии. На настоящий момент проводится исследование полученных белков, что позволит установить участие доменов белка CrmB в процессе олигомеризации.

Таким образом, вирусные иммуномодуляторы, в отличие от своих клеточных аналогов, способны к образованию стабильных олигомеров в отсутствие лиганда, что, по-видимому, увеличивает эффективность связывания вирусных иммуномодуляторов с клеточными белкамимишенями.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант 09-04-00055-а).

Научный руководитель – канд. биол. наук Т. С. Непомнящих.

ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗА M1.BSPACI: КЛОНИРОВАНИЕ,

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА И АНАЛИЗ БИОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

ФЕРМЕНТА

–  –  –

Сайт-специфичные ДНК-метилтрансферазы (метилазы) – это ферменты, катализирующие перенос метильной группы от донора, Sаденозил-L-метионина (SAM), на адениновое или цитозиновое основание в определенной последовательности ДНК. Как правило, метилазы вместе с эндонуклеазами рестрикции образуют системы рестрикции-модификации (RМ-системы). RM-системы, ферменты которых узнают несимметричные последовательности ДНК (тип IIS) включают как минимум две метилазы, каждая из которых модифицирует лишь одну из цепей ДНК. Ранее нами был обнаружен штамм Bacillus psychrodurans AC, содержащий RMсистему, рестриктаза которой узнат последовательность 5’-CCGC-3’.

Целью данной работы было изучение одной из метилаз данной RMсистемы. Для этого был клонирован фрагмент хромосомной ДНК B.

psychrodurans AС, включающий, по даным анализа его нуклеотидной последовательности, гены двух С5-метилазы: M1.BspACI и M2.BspACI.

Ген bspACIM1 был клонирован в составе вектора pJW2 и экспрессирован в клетках E.coli. Препарат фермента M1.BspACI был получен путем очистки в пять хроматографических стадий. M1.BspACI проявляет максимальную активность при 30C и pH 8. Фермент модифицирует первый остаток цитозина в последовательности узнавания 5’-CCGC-3’. Определены кинетические параметры реакции метилирования ДНК ферментом M1.BspACI. Каталитическая константа оказалась равной 0,095 + 0.002 минKM ДНК фага – 0,053 + 0.007 мкМ, KM SAM – 5,1 + 0,3 мкМ.

Ранее в нашей лаборатории было показано, что KМ ДНК, установленные для метилаз IIS типа, существенно выше KМ ДНК для метилтрансфераз, узнающих симметричные нуклеотидные последовательности. Повидимому, это связано с различными механизмами реакции метилирования, катализируемой ферментами этих двух типов. Полученное нами значение KM ДНК M1.BspACI согласуется с этой закономерностью.

Кроме того, мы показали, что каталитическая константа для метилаз IIS типа ниже, чем для метилаз с симметричными узнаваемыми последовательностями.

Научные руководители – д-р биол. наук, проф. С. Н. Загребельный, канд. биол. наук Д. А. Гончар.

АНАЛИЗ ИМПРИНТИНГА В ИНДУЦИРОВАННЫХ

ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТКАХ

–  –  –

Недавние исследования группы японских ученых под руководством Яманаки показали, что введение в геном фибробластов четырех транскрипционных факторов (Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc) превращает их в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК). Бурное развитие тематики ИПСК в прошедшие три года открыло широчайшие возможности применения этой технологии в медицине.

На сегодняшний день показана возможность получения ИПСК как при помощи ретровирусной трансфекции двумя факторами (Oct4 и Sox2), так и плазмидной временной трансфекцией четырьмя факторами. Однако оба эти подхода не позволяют использовать полученные клетки в терапии человека, поскольку сопряжены либо со встройкой ретровирусов в геном, либо с использованием онкогенов c-Myc и Klf4. В данной работе впервые получены ИПСК при помощи плазмидной временной трансфекции двумя факторами (Oct4 и Sox2). При анализе метилирования регуляторной облости гена Oct4 (ключевого транскрипционного фактора в системе поддержания плюрипотентности) оказалось, что полученные клетки занимают промежуточное положение между эмбриональными стволовыми клетками и фибробластами. Вероятно, эффективность репрограммирования снижается при использовании двух факторов вместо четырех, а также при проведении временных трансфекций без интеграции в геном. При этом достаточно двух факторов (Oct4 и Sox2) чтобы провести изменения эпигенетического статуса клетки. Это ставит вопрос о сохранности эпигенетического статуса генов, не связанных с плюрипотентностью. Примером таких генов являются импринтированные гены. Если процесс репрограммирования сопровождался бы аберрациями в метилировании их промоторов, то получаемые ИПСК нельзя было бы применять в медицине, поскольку нарушения геномного импринтинга связаны с рядом тяжелых заболеваний. В связи с этим нами был проведен анализ метилирования регуляторных регионов импринтированных генов H19 и Peg3. Оказалось, что процесс репрограммирования не затрагивает геномный импринтинг и, следовательно, предложенный метод получения ИПСК является достаточно безопасным.

Научный руководитель – Н. Р. Баттулин.

АНАЛИЗ АМИНОКИСЛОТНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

ИНУЛИНАЗ И ЛИПАЗ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ПРОДУЦЕНТОВ

–  –  –

При изучении молекулярных механизмов действия гидролаз, как правило, недостаточно исследования структурно-функциональных свойств биохимическими методами, а необходимо осуществление детального анализа белковых макромолекул на всех уровнях их организации. С этой целью нами был проведен сравнительный анализ аминокислотных последовательностей инулиназ (КФ 3.2.1.7) и липаз (КФ 3.1.1.3) из разных продуцентов.

Сведения о первичных структурах ферментов получали из базы данных Национального центра биотехнологической информацим США выравнивание аминокислотных (http://www.ncbi.nlm.hin.gov/Entrez), последовательностей проводили при использовании программного пакета Alibee-Multiple Aligment (http://www.genebee.msu.ru/malign_reduced.html).

Сравнение первичных структур изучаемых ферментов осуществляли с помощью программ Gene Bee (http://www.genebee.msu.ru/genebee.html) и Gene Doc (http://www.psc.edu/biomed/genedoc/).

Установлено, что остатки глутамина, аспарагина, аргинина и триптофана представляют собой элементы участков консервативных последовательностей инулиназ. Показана высокая степень гомологии для инулиназ Aspergillus awamori и Aspergillus niger, самые существенные отличия обнаружены между ферментами из Geobacillus stearothermophilus и Penicillum sp. TN-88.

Выполненный нами сравнительный анализ первичных структур липаз, выделенных из продуцентов семейства Мucoraceae (Rhizomucor miehei, Rhizopus niveus, Rhizopus arrhizus, Rhizopus oryzae) показал, что степень их гомологии составляет 61,7%. Остатки каталитической триады серин– гистидин–аспарагиновая кислота входят в состав консервативных участков полипептидных цепей ферментов данной группы. Шесть остатков цистеина, участвующих в образовании дисульфидных мостиков, занимают фиксированные позиции, а для липаз рода Rhizopus локализованы в гомологичных фрагментах цепей.

Научный руководитель – д-р биол. наук, проф. Т. А. Ковалева.

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТАГЕНОМНОЙ ДНК ПОЧВ НА НАЛИЧИЕ

ГЕНА КСИЛОЗОИЗОМЕРАЗЫ

А. О. Цырульников, В. В. Галиев Новосибирский государственный университет Новосибирский государственный педагогический университет С середины 1990-х годов бурно развивается метагеномный подход, т. е.

выделение и анализ тотальной ДНК из определенного образца окружающей среды (почвы, воды и т. д.). Данный комплекс методов позволяет анализировать ДНК абсолютно всех микроорганизмов, входящих в сообщество участка какого-либо водоема и суши, с которого был взят образец. Таким образом, становится возможным нахождение абсолютно новых ферментов из бактерий, ранее не анализировавшихся изза невозможности их культивирования. Благодаря данному подходу были найдены такие ферменты, как амидазы, амилазы, эстеразы/липазы, алкоголь-оксидоредуктазы, а также гены устойчивости к антибиотикам.

Идея нашей работы заключатся в использовании комплекса метагеномных методов для поиска фермента ксилозоизомеразы, использующегося в производстве глюкозо-фруктозных сиропов и не имеющего коммерчески доступных аналогов на российском рынке.

Основные этапы работы включают в себя:

1. Выделение суммарной ДНК из образца.

2. Обработка ее эндонуклеазами рестрикции с последующим лигированием образовавшихся фрагментов ДНК с векторными молекулами.

3. Скрининг полученной метагеномной библиотеки либо по функциональной активности (поиск бактериальных клонов, несущих гены функционально активных ферментов), либо ПЦР-скрининг с вырожденными праймерами, подобранными на консервативные участки генов целевых белков).

В рамках данного исследовательского проекта был завершен ряд работ:

определен оптимальный метод извлечения и очистки ДНК из почвенных организмов, составлен банк генов ксилозоизомеразы различных микроорганизмов, на основании вышеупомянутого банка генов были составлены праймеры, которые чувствительны к широкому спектру генов ксилозоизомеразы из известных микроорганизмов.

Научный руководитель – д-р биол. наук, проф. С. Н. Загребельный.

БИОХИМИЧЕСКАЯ ТЕХНОЛОГИЯ УЛУЧШЕНИЯ СОРТОВ

КУЛЬТУРНЫХ РАСТЕНИЙ

–  –  –

Известно, что значительная часть посевных площадей Центральноазиатского региона страдает разной степенью засоления. В настоящее время с усыханием бассейна Аральского моря ситуация в этом регионе и в близлежащих областях становится весьма критической в связи с еще большим засолением. Снижается урожайность и качество важнейших сельскохозяйственных культур, в том числе и хлопчатника, нарушаются сложившиеся биоценозы, что может привести к нарушению экологического баланса. Влияние этих нарушений ощущается и на социальной обстановке. В складывающейся ситуации сохранение природной обстановки и обеспечение населения необходимыми элементами жизнеобеспечения становится весьма актуальным и крайне необходимым, причем сроки проведения соответствующих мероприятий должны быть максимально короткими. Становится очевидным, что необходимы альтернативные методы и технологии, которые позволили бы ускорить повышение толерантности к засолению и засухе существующих культурных и диких форм растений, а также сократить время выведения новых сортов растений с комплексной толерантностью ко многим неблагоприятным факторам окружения. Приемы разработанных в нашей лаборатории технологий открывают для этого достаточно широкие возможности.

Нами показано, что в ходе микроэволюционных процессов в сортовых и природных популяциях возникают адаптивные биотипы, у которых усиливается механизм, обеспечивающий толерантность к отрицательным воздействиям. Методика, разработанная нами, позволяет очень быстро выявлять подобные биотипы из популяций растений. В основе ее биохимические маркеры функционально связанные с проявлением многих полезных признаков. Используя ее можно быстро выделять и далее размножать необходимые генотипы, что позволяет втрое ускорить процесс селекции новых сортов, а также улучшить существующие. На основе данной технологии получены и переданы в государственное тестирование новые линии, превосходящие по основным хозяйственным и физиологическим признакам исходные сорта.

Научный руководитель – д-р биол. наук, проф. Р. К. Шадманов.

ИЗУЧЕНИЕ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА

ЧЕЛОВЕКА IN VITRO С ПОМОЩЬЮ КЛОНОВ

ПСЕВДОТИПИРОВАННЫХ ВИРУСОВ

–  –  –

Проблема разработки вакцин против вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) заключается в том, что при инфекции, вызванной ВИЧ, не формируется протективный иммунитет, поскольку ВИЧ быстро эволюционирует, и вирусные белки обладают крайне высокой антигенной вариабельностью. Одним из подходов создания ВИЧ-вакцины является использование полиэпитопных вакцин, иммунная реакция на которые покрывает антигенное разнообразие ВИЧ. Основным показателем эффективности вакцины является вируснейтрализующая способность антител, индуцированных этой вакциной. Проблемы антигенной изменчивости ВИЧ-1 при испытаниях ВИЧ-вакцин преодолеваются путем применения панелей молекулярных псевдовирусов, env-клонов соответствующих различным субтипам ВИЧ-1. Подобные панели молекулярных клонов покрывают антигенное разнообразие внутри каждого субтипа ВИЧ-1, причем каждый клон сохраняет свои антигенные свойства без изменения. Задачей исследования было получение нескольких клонов псевдовирусов ВИЧ-1 из стандартной панели envклонов ВИЧ-1 субтипа В, изучение с помощью этих клонов вируснейтрализующих свойств иммунных сывороток и проведение пептидного картирования ВИЧ-нейтрализующих эпитопов белка TBI. Для решения поставленных задач была проведена наработка и характеризация методом рестрикционного анализа плазмид экспрессии, несущих гены белков ВИЧпроведена котрансфекция культуры клеток 293 Т/17 для получения клонов псевдовирусов, определена инфекционность полученных псевдовирусов на культуре TZM-bl клеток и изучена вирусная нейтрализация сыворотками крови, выделенными от ВИЧинфицированных людей, и от мышей, иммунизированных полиэпитопным по ВИЧ белком TBI. Методом конкурентного анализа в реакции нейтрализации проведено пептидное картирование ВИЧ-нейтрализующих эпитопов белка TBI. Показано, что около 5% сывороток крови ВИЧинфицированных способны нейтрализовать псевдовирусы В субтипа.

Титры нейтрализации для сывороток нон-прогрессоров и TBIиммунизированных мышей близки по величине. В-эпитопы ВИЧ в белке TBI отличаются по способности индуцировать нейтрализующие антитела.

Научный руководитель – канд. биол. наук А. Б. Рыжиков.

КАПСУЛЬНЫЙ ПОЛИСАХАРИД БАКТЕРИЙ

HERBASPIRILLUM SEROPEDICAE Z78

Н. С. Шишонкова, О. Н. Смолькина, В. В. Игнатов Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, г. Саратов Бактерии рода эндофитные ассоциативные Herbaspirillum, азотфиксаторы принадлежащие к -субклассу Proteobacteria, являются перспективным модельным объектом для изучения растительномикробной ассоциации. В формировании таких взаимодействий существенную роль играют полисахариды бактериальной поверхности.

Данные по методам выделения и исследованию химического состава поверхностных гликополимеров Herbaspirillum практически отсутствуют.

Целью данной работы было выделение и характеристика полисахарида из капсульного материала H. seropedicae Z78. Бактериальную культуру выращивали на жидкой синтетической среде с малатом и глюкозой до окончания экспоненциальной фазы роста. Полисахариды экстрагировали из высушенных ацетоном капсулированных клеток 95% фенолом с разделением слоев. Водную и фенольную части экстракта обрабатывали протеиназой K. Экстракты ультрацентрифугировали для отделения липополисахаридов. Из супернатантов добавлением трехкратного объема ацетона осаждали капсульные полисахариды КПСв/ч и КПСф/ч. Полученные осадки растворяли и фракционировали на колонке с носителем Sephadex G-50. После лиофилизации выход высокомолекулярных фракций КПС в/ч и КПСф/ч составил 0,21 и 0,48 % от массы сухих клеток. В результате анализа КПСв/ч и КПСф/ч в их составе были выявлены углеводы 17,5 и 8,8%, фосфор 4,1 и 4,3 % и следовые количества белка. Нуклеиновые кислоты и 2-кетодезоксиоктоновая кислота обнаружены не были. Исследование выделенных препаратов методом с SDS-ПААГ-электрофореза последующим окрашиванием серебром на углеводы показало, что они гетерогенны по молекулярной массе. Электрофоретические профили характеризовались наличием полос, как в верхней, так и в нижней области треков. Однако полоса в верхней части трека КПСв/ч была шире, что указывает на большее присутствие молекул с высокой молекулярной массой. Для КПСв/ч также была выявлена полоса в средней части трека.

Методом ГЖХ после метанолиза в препаратах были найдены жирные кислоты с длиной цепи от С11 до С24. Преобладающие в КПСв/ч были C16:0, С18:0 и i-C17:0 в соотношении 3:2:1, а в КПСф/ч C16:0 и С18:0 в соотношении 1:1. Методом ГЖХ в виде ацетатов полиолов было показано, что КПС в/ч и КПСф/ч имеют сходный моносахаридный состав и построены из Man, Gal и Glc в соотношении 1:6:2 для КПСв/ч и 1:5:3 для КПСф/ч.

Работа частично поддержана грантом НШ 3171.2008.4.

Научный руководитель – д-р биол. наук, проф. В. В. Игнатов.

ЦИТОЛОГИЯ И ГЕНЕТИКА

ВЛИЯНИЯ ОТБОРА ПО ПОВЕДЕНИЮ И ФАКТОРОВ РАННЕЙ

СРЕДЫ НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ, УЧАСТВУЮЩИХ В

РЕГУЛЯЦИИ ГИПОТАЛАМО-ГИПОФИЗАРНОНАДПОЧЕЧНИКОВОЙ СИСТЕМЫ КРЫС

–  –  –

Гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система является древней физиологической стресс-системой. Она играет центральную роль в реакции организма на изменения факторов внешней среды. Конечным звеном гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы являются глюкокортикоиды, которые оказывают разнообразные эффекты на ткани и системы организма, изменяя метаболизм, сердечно-сосудистую систему, иммунную реактивность, репродуктивную функцию, поведенческие реакции, а также влияющие на настроение, обучение, память и познавательную способность.

Целью данной работы является изучение влияний факторов генотипа и ранней среды на гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковую систему и ее регуляцию, в частности на экспрессию гена рецептора глюкокортикоидов (ГР).

Эксперимент проводился на серых крысах, селекционируемых на усиление и элиминацию агрессивного поведения по отношению к человеку. В качестве стрессорного воздействия применялся неонатальный хэндлинг: короткое (15 мин) ежедневное разлучение детенышей с их матерью с 1-го по 12-й дни жизни. Для исследования экспрессии гена ГР проводились выделение РНК из соответствующих тканей (гиппокамп, селезенка, печень), получение кДНК с помощью обратной транскрипции, ПЦР в реальном времени. Результаты статистически обрабатывались в программе REST.

Полученные данные свидетельствуют о различиях в экспрессии гена ГР в гиппокампе ручных и агрессивных крыс. Исследование таких периферических тканей, как селезенка и печень, не обнаружило достоверных различий между группами. Также показано, что агрессивная линия наиболее чувствительна к воздействию неонатального хэндлинга.

Научный руководитель – канд. биол. наук И. Н. Оськина.

ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНА SYNTAXIN5 МОЛЕКУЛЯРНЫМИ И

ЦИТОЛОГИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

–  –  –

Синтаксин 5 D. melanogaster принадлежит к классу target-SNARE белков, которые участвуют в специфическом узнавании и слиянии мембран. К настоящему времени во многих исследованиях показано участие продукта этого гена в передаче нервного сигнала, однако его участие в других клеточных процессах остается невыясненным.

Нами был проведен цитогенетический и молекулярный анализ гена синтаксин 5 у D. melanogaster и изучено влияние различных его аллельных комбинаций на клеточное деление. Мы показали, что комбинация P-элементного аллеля syx5EP2313 c точечной мутацией syx5AR113 вызывает нарушения в клеточном делении как в мейозе, так и в предмейотических митозах. В норме каждая сперматида на стадии луковицы, которая следует за вторым делением мейоза, должна иметь одно ядро и одно митохондриальное производное (небенкерн) одинакового размера. У мутантов отдельные сперматиды содержат один гигантский небенкерн, окруженный группой из 2, 8, 16 и 32 ядер, такие сперматиды не переходят в дальнейшую фазу созревания и элонгации. Для аллеля syx5EP2313 мы провели выщепление P-элемента с анализом полученных линий на восстановление фертильности и показали, что именно встройка P-элемента вызывала наблюдавшиеся нарушения.

Из базы данных Flybase известно, что с гена синтаксин 5 считываются два разных транскрипта – RA и RB. Нами был проведен сравнительный анализ экспрессии RA и RB в органах Drosophila melanogaster методом обратной полимеразной цепной реакции. Различий в паттерне экспрессии двух транскриптов выявлено не было.

Мутации в гене синтаксин 5 приводят к ранней эмбриональной гибели, что затрудняет исследование фенотипа. Для преодоления этого ограничения было предложено использовать специфическое подавление экспрессии синтаксина 5 при помощи РНК-интерференции.

Специфичность подавления достигается при помощи GAL4-UAS системы, позволяющей запускать вектор, предназначенный для метода РНКинтерференции в отдельных органах и тканях.

Научный руководитель: канд. биол. наук С. А. Федорова.

ВЛИЯНИЕ МУТАЦИЙ В ГЕНЕ PEANUT НА ЦИТОКИНЕЗ В

ГЕНЕРАТИВНЫХ И СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТКАХ DROSOPHILA

MELANOGASTER

–  –  –

Септины – это семейство белков, впервые найденное у дрожжей S. cerevisiae, и известное в настоящее время для большинства животных и грибов. Один из основных процессов, в которых участвуют септины, – это цитокинез. У дрозофилы известно 5 представителей данного семейства, в том числе септин, кодируемый геном peanut (pnut). Особи, гомозиготные по нуль-аллельной мутации pnutXP, погибают на стадии ранней куколки, эмбриональное и личиночное развитие происходит за счет материнского продукта. Личинки, гомозиготные по мутации pnutXP, имеют следующую особенность: нервные ганглии имеют нормальный размер, но при этом редуцированы все имагинальные диски, кроме половых.

Для изучения влияния септинов на цитокинез соматических клеток нами анализировалось деление клеток нервных ганглиев личинок D. melanogaster, гомозиготных по мутации pnutXP. Мы обнаружили высокий процент метафазных пластинок с плоидностью, кратной 2n. Это говорит о том, что мутация pnutXP приводит к нарушениям цитокинеза в соматических клетках. Помимо полиплоидии, у мутантов также наблюдались нарушения конденсации хромосом и нарушение прикрепления хромосом к веретену.

Влияние септинов на цитокинез клеток зародышевого пути исследовалось на моделях оогенеза и сперматогенеза дрозофилы. Для эксперимента использовались мухи, несущие различные аллельные комбинации гена pnut, доживающие до стадии имаго.

pnutXP/pnutDG05807 Морфология яйцевых камер самок и DG05807 DG05807 не отличается от нормы: каждая камера имеет 15 pnut /pnut питающих клеток и один ооцит, расположенный на заднем конце. В семенниках таких самцов нарушений цитокинеза в клетках зародышевого пути также не наблюдалось. Из этого следует, что деление половых клеток у мутантов по гену pnut не нарушено.

Таким образом, мы показали, что продукт гена pnut влияет на цитокинез в соматических клетках, но не влияет на цитокинез в половых клетках.

Научный руководитель – канд. биол. наук, С. А. Фдорова.

IN VIVO АНАЛИЗ ПЛЮРИПОТЕНТНОСТИ ГИБРИДНЫХ

ES-КЛЕТОК, ИМЕЮЩИХ ТЕТРАПЛОИДНЫЙ КАРИОТИП

(НА МОДЕЛИ ИНЪЕКЦИОННЫХ ХИМЕР)

–  –  –

Основной целью данной работы является in vivo оценка плюрипотентности гибридных тетраплоидных ES-клеток, полученных при слиянии двух диплоидных ES-клеток линий: E14Tg2aSc4TP6.3 (Tau-GFP) и D3. Химерные мыши были получены инъекционным методом.

Облигатная экспрессия трансгена GFP в линии гибридных клеток D3T (субклоны D3T7 и D3T14) позволила визуализировать заселение ими тканей химер. Взрослых животных умерщвляли методом цервикальной дислокации, ткани фиксировались и помещались в поддерживающую среду. Были взяты образцы из 23-25 органов (ЖКТ, мочеполовая, дыхательная, сердечнососудистая системы, мозг), а также спонтанных опухолей, обнаруженных у 50% взрослых химер на момент забоя.

Микроскопирование, получение и анализ изображения выполнены с использованием флуоресцентного микроскопа Axioskop2 Plus на базе ЦКП микроскопического анализа биологических объектов ИЦиГ СО РАН.

(http://www.bionet.nsc.ru/microscopy/index.html) Было исследовано 11 химер (8 особей D3T14, 3 особи D3T7). При оценке колонизации было выявлено, что с частотой более 50 % заселяются ткани, которые входят в состав легких, сердца, глаз, селезенки, толстой кишки, грудины. Таким образом, было показано, что в ходе эмбриогенеза химер происходит заселение потомками введнной гибридной линии клеток всех трех зародышевых листков.

Гистологический анализ образцов опухолей (главным образом, они были обнаружены в молочных железах, кишечнике, щитовидной железе) показал, что новообразования происходят из железистой эпителиальной, лимфоидной, мышечной, соединительной тканей. Однако присутствия потомков GFP-маркированных гибридных клеток не было обнаружено.

Этот факт требует дальнейшего изучения для установления возможных механизмов, задействованных в увеличении частоты образования спонтанных опухолей у химер.

Таким образом, в соответствии с анализом тканей взрослых химер можно заключить, что субклоны D3T7 и D3T14 высокоплюрипотентны и в целом не отличаются друг от друга.

Работа поддержана грантами РФФИ № 09-04-01369 и компании Сarl Zeiss (2009 г.).

Научный руководитель – канд. биол. наук, ст. науч. сотр.

Е. А. Кизилова.

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ИНДУЦИРОВАННЫХ

ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ИЗ

ЭМБРИОНАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ КОЖИ ЧЕЛОВЕКА

–  –  –

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) получают из соматических клеток взрослого организма методом внедрения экспрессирующихся векторов, несущих гены поддержания плюрипотентного состояния. Изучение и разработка методов получения ИПСК поможет в исследовании механизмов репрограммирования соматического генома и поддержания плюрипотентности.

В данной работе ИПСК человека были получены трансдукцией эмбриональных фибробластов кожи человека ретровирусными векторами, несущими гены Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc мыши. На 30-й день культивирования было получено 18 стабильных ЭСК-подобных линий, 4 из которых были далее охарактеризованы. ПЦР-анализ ДНК, выделенной из клеток полученных культур, показал, что во всех линиях ИПСК произошла интеграция вирусной ДНК в геном. По морфологии полученные линии ИПСК схожи с ЭСК (эмбриональные стволовые клетки) человека, экспрессируют щелочную фосфатазу- биохимический маркер недифференцированных клеток. Иммунофлуоресцентный анализ показал, что в полученных линиях ИПСК происходит экспрессия транскрипционных факторов OCT4, NANOG, а также поверхностных антигенов SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81- характерных для ЭСК человека.

ОТ-ПЦР анализ транскрипции генов показал, что полученные ИПСК схожи по паттерну экспрессии генов плюрипотентности как с ЭСК человека линии HUES9, так и между собой.

Для оценки спектра дифференцировки были получены эмбриоидные тельца.

ОТ-ПЦР анализ транскрипции генов показал, что в клетках эмбриоидных телец происходит экспрессия маркеров дифференцировки:

экто-, мезо-, энтодермы.

Научный руководитель – д-р биол. наук, проф. С. М. Закиян.

РОЛЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК ДЛИНОЙ 246 ПАР

ОСНОВАНИЙ ИЗ РАЙОНА 3С6/С7 DROSOPHILA MELANOGASTER

В ФОРМИРОВАНИИ МЕЖДИСКА

Е. Р. Бильданова, О. В. Андреенков, Е. И. Волкова, В. Ф. Семешин Новосибирский государственный университет Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН Вопрос о том, какие последовательности необходимы и достаточны для формирования декомпактной структуры междисков политенных хромосом дрозофилы до сих пор остается открытым.

В настоящей работе на примере междисковой ДНК из района 3С6/С7 был использован новый подход для изучения способности различных последовательностей ДНК автономно формировать междиск в заданном генетическом окружении. Тестируемые последовательности ДНК из этого района, фланкированные FRT сайтами, в составе донорного транспозона pFRTV встраивали в геном дрозофилы. После сведения таких конструкций с акцепторным транспозоном pICon(dV) и источником FLP рекомбиназы в едином геноме происходит вырезание тестируемой последовательности из донорного транспозона по FRT сайтам и ее последующая интеграция в акцепторный транспозон. pICon(dV) расположен в хорошо охарактеризованном цитологически районе 84F хромосомы 3 и состоит из образующих дисковые структуры последовательностей, разделенных сайтом FRT, по которому происходит встройка. Электронномикроскопичекий анализ препаратов политенных хромосом слюнных желез трансформированных мух позволяет выявлять в составе транспозона новые структуры, образуемые тестируемыми последовательностями.

Ранее был клонирован фрагмент длиной 1,5 т.п.н. из района 3C6/C7, включающий 900 пар, удаляемые делецией faswb. Оба фрагмента ДНК – 1,5 т.п.н. и 900 п.н. образуют междиск в составе транспозона pICon(dV).

Известно, что делеция faswb длиной около 900 п.н. из района 3С6/C7 приводит к исчезновению междиска. Таким образом, последовательность, удаляемая делецией faswb необходима и достаточна для формирования междиска.

В составе изучаемой последовательности в районе 3C6/C7 выявлен участок около 250 п.н., проявляющий гиперчувствительность к ДНКазе I.

Из исходного 1,5 т.п.н. фрагмента этот участок был удален, полученная последовательность ДНК длиной 1,25 т.п.н. не образует новый междиск в транспозоне pICon(dV). Таким образом, небольшой фрагмент из района 3С6/С7, содержащий ДНКазаI-гиперчувтвительный сайт, является необходимым для формирования междиска Научный руководитель – д-р биол. наук С. А. Демаков.

ДИНАМИКА ИНФИЦИРОВАННОСТИ ПРИРОДНЫХ И

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ DROSOPHILA

MELANOGASTER РАЗНЫМИ ГЕНОТИПАМИ ЭНДОСИМБИОНТА

WOLBACHIA

–  –  –

– это внутриклеточная симбиотическая альфаWolbachia протеобактерия, широко распространенная среди членистоногих и нематод. Передача бактерии от особи к особи происходит вертикально и только по материнской линии. Wolbachia в ряде случаев способна индуцировать у вида-хозяина различные репродуктивные аномалии, направленные на увеличение доли инфицированных особей в популяции.

Так, у многих видов дрозофилид Wolbachia может вызывать цитоплазматическую несовместимость. Но для Drosophila melanogaster показано отсутствие или слабое влияние бактерии на репродуктивную функцию, хотя доля инфицированных особей варьирует от 10 до 100 %.

Столь значительное распространение бактерии требует ответа на вопрос о роли бактерии в биологии D. melanogaster. Для D. melanogaster описано 5 генотипов Wolbachia, наиболее распространены три – wMel, wMelCS и wMelCS2, при этом генотип wMel встречается наиболее часто (99 %), а генотипы wMelCS и wMelCS2 значительно реже (1 %).

В работе осуществляется попытка оценить влияние различных генотипов Wolbachia на репродуктивную функцию D. melanogaster. Это позволит оценить паразитическое и/или мутуалистическое влияние бактерии на вид-хозяин. Проведено экспериментальное исследование динамики инфицированности популяций D. melanogaster генотипами Wolbachia wMel и wMelCS. Были созданы 3 искусственные популяции: 1) инфицированная генотипами wMel и wMelCS 2) мухи инфицированые генотипом wMel и неинфицированные, 3) мухи инфицированые генотипом wMelCS и неинфицированные. К девятому поколению для популяции 1 наблюдается достоверное смещение частоты инфицированности генотипом wMel, что согласуется с наблюдениями частот генотипов в природных популяциях. В популяциях 2 и 3 отмечена тенденция увеличения доли инфицированных особей. На основе модели динамики частот матерински наследуемого фактора определяется влияние Wolbachia на репродуктивную функцию Обсуждается D. melanogaster.

мутуалистическое и паразитическое влияние бактерии на D. melanogaster.

Работа поддержана грантом РФФИ № 09 04 00 872а Научный руководитель – канд. биол. наук Ю. Ю. Илинский.

ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ЭПИТЕЛИАЛЬНОГО

НАТРИЕВОГО КАНАЛА (ENAC) В ПОЧКАХ КРЫС ЛИНИИ

НИСАГ С НАСЛЕДУЕМОЙ ИНДУЦИРУЕМОЙ СТРЕССОМ

АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИЕЙ

–  –  –

В ИЦиГ СО РАН была получена линия крыс НИСАГ, характеризующаяся повышенным базальным уровнем артериального давления и резким повышением артериального давления в условиях мягкого эмоционального стресса. Известно, что развитие артериальной гипертензии связано с нарушением функции почек. Важную роль в процессе поддержания их нормальной функции играют гены ионных транспортеров.

ENaC – это класс ионных каналов, основной функцией которого является регуляция реабсорбции натрия. Канал ENaC состоит из трех субъединиц: альфа, бета и гамма (ENaC-, ENaC- и ENaC-). В почках, все три субъединицы ENaC локализованы в апикальной мембране собирательных канальцев дистальной части нефрона.

Целью нашей работы являлось изучение экспрессии гена кодирующего субъеденицу ENaC- в почках крыс НИСАГ в покое и под действием эмоционального стресса. Поскольку почка является структурно и функционально гетерогенным органом, изучение экспрессии генов проводили отдельно в корковом и мозговом веществе почки методом полимеразной цепной реакции в реальном времени.

Измерения показали:

1. в корковом веществе почки снижение экспрессии гена ENaC- у крыс НИСАГ по сравнению с крысами WAG в покое.

2. в мозговом веществе почки повышение экспрессии гена ENaC- у гипертензивных крыс НИСАГ по сравнению с крысами WAG в покое.

3. в мозговом веществе почки повышение уровня экспрессии гена ENaCу крыс обеих линий под воздействием эмоционального стресса.

Результаты работы позволяют предполагать важную роль гена ENaCв формировании гипертонии у крыс линии НИСАГ.

Работа поддержана грантами РФФИ № 08-04-01048 и Министерства науки и образования РФ № 3H-319-09.

Научный руководитель – канд. биол. наук O. E. Редина.

ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ

ОРГАНИЗАЦИИ ПРОМОТОРА ГЕНА

ОРНИТИНАМИНОТРАНСФЕРАЗЫ ARABIDOPSIS THALIANA

–  –  –

Считается, что основная функция фермента орнитинаминотрансферазы (ОАТ), локализованного в митохондриях, заключается в синтезе пролина из орнитина. Также существует гипотеза о том, что ОАТ может участвовать в контроле метаболизма азота. Ранее в лаборатории генной инженерии ИЦГ СО РАН было показано, что трансгенные растения табака, экспрессирующие ген ОАТ люцерны, характеризуются повышенной устойчивостью к солевому стрессу, но по содержанию пролина не отличаются от контроля. Для исследования роли гена ОАТ в регуляции стрессоустойчивости нами было запланировано исследовать особенности его транскрипционного контроля. Целью данной работы является изучение структурно-функциональной организации промотора гена ОАТ Arabidopsis thaliana.

Для этого нами было сделано следующее:

(1) Клонирован участок геномной ДНК, прилежащий к белоккодирующему району гена ОАТ. (2) С помощью методов компьютерного анализа это участка ДНК выявлены потенциальные сайты связывания транскрипционных факторов. Обнаружено, что эти сайты могут быть вовлечены в контроль экспрессии в условиях засоления, засухи, экстремальных температур. (3) Для проверки этих предсказаний создан набор из трех генетических конструкций – делеционных вариантов промоторного района, под контролем которых расположен репортерный ген бета-глюкуронидазы E. coli. Конструкции созданы на основе бинарного вектора pBi и содержат участки промотора ОАТ, контролирующие ген-репортер. На основе имеющихся конструкций получены трансгенные растения Nicotiana tabacum, анализ экспрессии гена-репортера у трансгенных растений позволит ответить на вопрос: как изменяется транскрипционная активность промотора ОАТ в ответ на стрессовые воздействия различной природы. Первичный анализ растенийтрансформантов показал, что в нормальных условиях на ранних стадиях развития экспрессия ОАТ инициируется в точках роста.

Научный руководитель – канд. биол. наук, доцент А. В. Кочетов.

АССОЦИАЦИЯ ДВУХ ПОЛИМОРФНЫХ ЛОКУСОВ ГЕНА

ПЕРЕНОСЧИКА ДОФАМИНА DAT1 (SLC6A3) С РИСКОМ

ФОРМИРОВАНИЯ АЛКОГОЛЬНОЙ ЗАВИСИМОСТИ

В ЯКУТСКОЙ И РУССКОЙ ПОПУЛЯЦИЯХ

–  –  –

Многие исследования в области нейрофизиологии указывают на важнейшую регуляторную роль белков-переносчиков, осуществляющих обратный транспорт нейромедиатора в пресинаптический нейрон. К числу таковых относится и переносчик дофамина (DAT). С его патологией связывают риск возникновения аддиктивных расстройств, наибольший интерес из которых для нас представляет алкоголизм.

Объектом исследования выбраны две этнические группы – русские (популяция г. Томска; N=82 – контроль, N=146 – группа больных алкоголизмом,) и якуты (N=269 – контроль, N=135 – группа больных).

Анализ проводился для двух полиморфных локусов гена DAT1:

полиморфизм числа тандемных повторов в 3’-нетранслируемой области (VNTR) и 1342 A/G полиморфизм в 9-м экзоне (rs6347). Во всех популяционных выборках наблюдаемое распределение частот генотипов соответствовало ожидаемому при равновесии Харди-Вайнберга.

Выборки больных характеризуются большей гетерозиготностью по обоим локусам в сравнении с соответствующим контролем. У якутов – 0,20 против 0,16 (VNTR) и 0,29 против 0,19 (rs6347). У русских – 0,38 против 0,33 (VNTR) и 0,43 против 0,39 (rs6347). Между выборками больных и контроля якутской популяции найдены статистически значимые отличия по частотам генотипов rs6347 (p=0,02) и близкие к таковым по частотам генотипов VNTR (p=0,06). У русских отличий не найдено.

По локусу VNTR во всех выборках, как русских, так и якутов, преобладал аллель с 10 повторами (10R); аналогично чаще встречался Aаллель локуса rs6347. Редкие аллели (9R-аллель и G-аллель) имели большую частоту в выборках больных относительно контроля. Для них был посчитан критерий Odds Ratio (OR) – отношение шансов развития заболевания. У якутов по обоим локусам значения OR одинаковы и равны 1,7 при p 0,05, тогда как у русских эти значения статистически незначимы.

При общем тренде к большей гетерозиготности в выборках больных алкоголизмом, слабая ассоциация полиморфизмов гена DAT1 с риском развития заболевания показана только для якутского этноса.

Научный руководитель – канд. биол. наук А. В. Марусин.

ИССЛЕДОВАНИЕ ОПУШЕНИЯ ЛИСТА ПШЕНИЦЫ TRITICUM

AESTIVUM L. С ПОМОШЬЮ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫХ

МЕТОДОВ ФЕНОТИПИРОВАНИЯ

А. В. Дорошков, М. А. Генаев Институт цитологии и генетики СО РАН

Одним из важных фенотипических признаков растений является опушение листа. Опушение листа пшеницы имеет большое значение, влияя на микроклимат вблизи поверхности листа (влажность, температуру и т.п.), а также защищая от ряда вредителей. До недавнего времени морфологические характеристики опушения листа пшеницы оценивались на ощупь или визуальным подсчетом под микроскопом, что являлось неэффективным и не позволяло получать его точные характеристики.

Ранее нами был предложен компьютерный метод для решения задач анализа морфологии опушения листа пшеницы при помощи алгоритмов обработки изображений. Разработанная нами программа LHDetect интегрирована с базой данных WheatDB (www.wheatdb.org), созданной для обработки, хранения и оперативного доступа к данным по взаимосвязи генотип-фенотип-окружающая среда у пшеницы. Высокая информативность получаемых данных, а так же возможность применения к ним эффективных методов многомерного статистического анализа позволяет описывать морфотип опушения листа с необходимой точностью. Нами был проведн анализ проявления признака. На примере двух неродственных генотипов пшеницы было показано, что опушение листа формируется равномерно, и общее количество и средневзвешенная длина трихом достоверно не отличается вдоль листовой пластинки. Были выявлены и детально описаны различия в морфологии опушения листа между образцами сортов Саратовская 29, Голубка и линии сорта Родина с интрогрессией генов контроля опушения от Aegilops speltoides.

Работа поддержана Программой РАН 22, подпрограммой «Происхождение и эволюция биосферы», Интеграционными проектами СО РАН 113 и 119, а также грантом научных школ НШ-2447.2008.4.

Научные руководители – канд. биол. наук Д. А. Афонников, канд. биол.

наук. Т. А. Пшеничникова.

ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ДРЕВНЕЙ ДНК КОСТНЫХ ОБРАЗЦОВ

ДЕНИСОВОЙ ПЕЩЕРЫ: ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЕ

ВЗАИМООТНОШЕНИЯ С СОВРЕМЕННЫМИ ВИДАМИ

–  –  –

Денисова пещера расположена в северо-западной части Горного Алтая и является уникальным объектом комплексного изучения палеолита. Пол пещеры состоит из мощной толщи отложений с четко выраженными литологическими слоями; датировка 11 слоя, залегающего на глубине около 2 м – 50 ± 12 тыс. лет. Микроклимат пещеры позволил сохраниться костным останкам 27 видов крупных млекопитающих, принадлежавшим как ныне живущим (косуля, архар, лошадь), так и вымершим (пещерный медведь, пещерная гиена, бизон) животным. Молекулярно-генетические исследования ДНК этих животных, представляют огромный интерес с точки зрения филогенетических взаимоотношений с ныне живущими видами.

Изменение условий выделения древней ДНК, применение полногеномной амплификации (WGA) и стратегии вложенных праймеров позволили нам выделить и генотипировать 13 образцов древней ДНК Capreolus pygargus из 2 – 11 слоев раскопа и 2 образца представителей семейства Ursidae (Ursus arctos, U. (Spelaearctos) rossicus – 4, 11 слои, соответственно). Для получения гаплотипов современной косули сибирской, мы также выделили ДНК и генотипировали 33 современные косули Алтая, Новосибирской области, Тянь-Шаня и Якутии.

Филогенетический анализ последовательности нуклеотидов контрольного района (КР) мтДНК длиной 629 п.н. древних и современных сибирских косуль показывает, что на территории Алтая произошла смена популяций, по времени соотносящаяся с последним оледенением.

Гаплотипы образцов, принадлежащих к плейстоцену, наиболее близки к современным дальневосточным и якутским, к голоцену – курганским и новосибирским. В современной алтайской популяции C. pygargus следует отметить высокую гетерогенность гаплотипов.

Для древних представителей семейства Ursidae Денисовой пещеры и современных видов получено филогенетическое древо по последовательности КР мтДНК длиной 403 п.н. Малый пещерный медведь имеет общего предка с бурым, гималайским, белым медведями и значительно отличается от пещерного медведя, изучаемого в Европе.

Научный руководитель – канд. биол. наук, ст. науч. сотр.

Н. В. Воробьева.

К ВОПРОСУ О СИНУСОИДАЛЬНО-КЛЕТОЧНОЙ РЕАКЦИИ

ПЕЧЕНИ ПРИ ОСТРОМ И СУПЕРИНВАЗИОННОМ

ОПИСТОРХОЗЕ И ДЕЙСТВИИ ХОЛОДОВОГО ФАКТОРА

–  –  –

Обь-Иртышский бассейн является самым крупным эндемичным очагом описторхоза в мире. Кроме того, вс большее значение в последнее время приобретает также проблема влияния низкой температуры на организм человека и животных. Купферовские клетки, наряду с эндотелиоцитами, липоцитами и пит-клетками, составляют группу синусоидных клеток печени и являются среди них самыми многочисленными и функционально активными.

Цель работы: Оценить выраженность синусоидально-клеточной реакции печени при остром и суперинвазионном описторхозе и при действии холодового фактора.

В опыте находилось 120 сирийских хомяков. Животные были разделены на 4 группы: 1 – острый описторхоз (ОО); 2 – суперинвазионный описторхоз (СО); 3 – охлаждение животных при ОО (ООХ); 4 – охлаждение животных при СО (СОХ). Для моделирования ОО однократно вводили в глотку животных 50 метацеркарий, а для моделирования СО – 30 метацеркарий и на 21-е сутки вводили ещ 20 метацеркарий. Животных охлаждали по методике: при -20оС в течение 20 минут 10 раз – и выводили из опыта под эфирным рауш-наркозом на 3, 7, 15, 30, 60 и 90-е сутки после заражения описторхозом.

Окраска:

гематоксилин-эозин. Для оценки синусоидальной реакции печени рассчитывалось гепацитарно-синусоидальное число (количество синусоидальных клеток (СК) печени на 1000 гепатоцитов). Статистическая обработка проводилась с помощью IBM PC БИОСТАТ, версия 5,0.

При ОО максимум СК отмечался на 15-е сутки (248,6±8,7‰, P20,05, P40,05). При ООХ их максимум приходился на 30-е сутки (325,5±10,91‰, P40,05), причем более значительный, чем при ОО. При СО первое увеличение СК наблюдалось к 7-м суткам (172,7±19,3‰, P20,05, P40,05), а максимального значения оно достигало к 30-м суткам (219,6±13,58‰, P20,05, P40,05), что, вероятно, связано с повторным введением антигенного начала в данной экспериментальной группе. При СОХ первое увеличение СК отмечается на 15-е сутки (251,7±10,54‰, P40,05), повторное – на 60-е сутки (243±10,48‰, P40,05). Таким образом, при сочетании различных форм описторхозной инвазии отмечалась значительная активация СК печени.

Научный руководитель – д-р мед. наук, проф. В. П. Зуевский.

ИЗУЧЕНИЕ РАННИХ СТАДИЙ РЕПРОГРАММИРОВАНИЯ

ГЕНОМОВ В ГИБРИДАХ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ

КЛЕТОК С ТЕТРАПЛОИДНЫМИ ФИБРОБЛАСТАМИ

–  –  –

Гибридизация эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) с диплоидными соматическими клетками является эффективным способом восстановления потенциала дифференцированных клеток и получения аутологичных клеток с ЭСК-свойствами. В то же время показано, что гибриды между ЭСК и тетраплоидными соматическими клетками утрачивают характерный для ЭСК фенотип и плюрипотентность. Для выяснения причин и механизмов феномена альтернативного проявления плюрипотентности необходимо изучение ранних стадий репрограммирования соматического и плюрипотентного геномов в данной системе.

Работа посвящена иммуноцитохимическому анализу динамики ключевых белков-маркеров ЭСК и фибробластов в гибридных клетках, полученных слиянием диплоидных ЭСК и тетраплоидных фибробластов на ранних стадиях (от 4-х до 100 часов после слияния клеток-партнеров).

Показано, что доля клеток, в ядрах которых присутствуют белки Oct4 и Nanog – главные транскрипционные факторы, необходимые для поддержания плюрипотентности в ЭСК, стремительно снижается в популяции гибридов уже в первые часы после слияния. К первым суткам после гибридизации вся популяция гибридных клеток характеризуется отсутствием белков Oct4 и Nanog в ядрах клеток. Гибридные клетки были анализированы на наличие белков-маркеров фибробласта (коллаген I-го типа, фибронектин), а также специфичного только для дифференцированных клеток белка ядерной мембраны ламина а/с.

Показано, что доля гибридных клеток, позитивных по всем трем маркерам, снижается в популяции гибридных клеток в первые часы после слияния на 35–40 % по сравнению с фибробластами (вероятно, под влиянием плюрипотентного генома), однако этот уровень восстанавливается до характерного для нормальных фибробластов (84–86 % для коллагена, фибронектина; 100 % для ламина а/с) уже к первым суткам после слияния.

Таким образом, соматический фенотип исследуемых гибридных клеток окончательно устанавливается спустя 22–24 часа после слияния.

Заключительная часть работы посвящена изучению влияния ингибиторов гистоновых деацетилаз на временные и качественные характеристики процесса репрограммирования в исследуемой системе.

Научный руководитель – д-р биол. наук, проф. О. Л. Серов.

ИЗУЧЕНИЕ УЛЬТРАСТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ

ЭМБРИОНАЛЬНЫХ, ГИБРИДНЫХ И ИНДУЦИРОВАННЫХ

ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК МЫШИ

–  –  –

Одной из актуальных проблем современной биологии является изучение механизмов репрограммирования генома соматических клеток. В настоящее время разработано несколько подходов к репрограммированию генома, таких как перенос соматического ядра в энуклеированную яйцеклетку, слияние дифференцированных клеток с плюрипотентными клетками, а также индуцирование соматических клеток к плюрипотентному состоянию. Целью данной работы было проведение сравнительного морфологического и морфометрического анализа эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и фибробластов мыши, репрограммированных до плюрипотентного состояния двумя различными методами: введением с помощью векторов генов плюрипотентности (Oct4, Sox2, Nanog, Lin28) – ИПС клетки, и слиянием с ЭСК мыши – эмбриональные гибридные клетки. Сравнительный анализ ЭСК и ИПС не выявил различий в их ультраструктурной организации. ИПС клетки, также как и ЭСК формируют островки, имеют округлую форму, крупное ядро, обедненную органеллами цитоплазму и узкие короткие цистерны ЭПР.

Сравнение ЭСК и гибридных клеток показало, что последние отличаются от ЭСК большими размерами клетки и ядра, а также более изрезанной ядерной оболочкой. Обнаруженные различия, по-видимому, связаны с увеличенной плоидностью гибридных клеток.

Научный руководитель – канд. биол. наук Е. В. Киселева.

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ

НУКЛЕОТИДОВ И ИНДИВИДУАЛЬНАЯ ГЕНОТОКСИЧЕСКАЯ

ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ У ДЕТЕЙ И ПОДРОСТКОВ,

ПОДВЕРГАЮЩИХСЯ ВОЗДЕЙСТВИЮ РАДОНА

А. А Лунина, А. В. Ларионов, А. В. Столяров Кемеровский государственный университет В настоящее время концентрация мутагенных веществ в контактных средах постоянно увеличивается. Наиболее важными системами защиты клеток от мутагенного воздействия являются система антиоксидантной защиты, ферменты трансформации ксенобиотиков и ферменты репарации ДНК [1]. Основным критерием чувствительности к мутагенной нагрузке служит частота и спектр хромосомных аберраций в лимфоцитах крови. В настоящее время установлена взаимосвязь повышения уровня хромосомных аберраций со снижением активности систем репарации ДНК. Многие гены репарации обладают ярко выраженным полиморфизмом, что позволяет предположить существенную роль в формировании индивидуальной наследственной чувствительности к мутагенной нагрузке.

Репарация ядерной ДНК эукариот включает несколько механизмов, одним из которых является эксцизионная репарация нуклеотидов (NER), участвующая в репарации объемных химических аддуктов ДНК, пиримидиновых димеров и других повреждений [2]. NER включает более 30 белков, 8 из них являются критически важными, к числу которых относятся и Xeroderma pygmentosum group XpD, XpC и XpG.

Целью нашей работы является изучение модифицирующего влияния генов эксцизионной репарации нуклеотидов на уровень индивидуальной токсико-генетической чувствительности у детей и подростков, подвергающихся хроническому воздействию излучения радона и дочерних продуктов его распада.

Были изучены хромосомные аберрации в 48-часовых культурах лимфоцитов периферической крови у 132 детей и подростков, возраст которых варьировал от 8 до 17 лет при среднем значении 13,02 ± 0,19 лет, проживающих и обучающихся в школе-интернате г. Таштагол. Ранее кафедрой генетики КемГУ в ходе экспедиционных выездов была выявлена повышенная активность радона в воздухе жилых и учебных помещений школы-интерната г. Таштагол Кемеровской области.

Параллельно с дозиметрией у детей и подростков, обучающихся и проживающих в интернате, было проведено изучение частоты и спектра хромосомных нарушений, результаты которого подтвердили наличие кластогенных эффектов воздействия повышенных доз радона [3].

Культивирование клеток крови и подготовка препаратов осуществлялись в соответствие со стандартной методикой. Для анализа полиморфизма генов XpD Lys751Gln, XpC Lys939Gln и XpG Asp1104His ДНК выделяли методом фенол-хлороформной экстракции. Молекулярногенетическое типирование проводили методом «SNP-экспресс» с использованием клинических наборов для тестирования SNP НПФ «Литех» (г.Москва). Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета программ Statsoft Statistica 6.0. Достоверность отличий между группами оценивали с использованием U –критерия Манна – Уитни.

В ходе проведенного исследования было зафиксировано достоверно значимое увеличение хромосомных аберраций в группе гомозигот по мутантному аллелю гена XpG Asp1104His. Различия между группами наблюдаются как по количеству аберраций на 100 клеток, так и по доле клеток с хромосомными аберрациями (табл.1). Модифицирующего влияния полиморфизма генов XpD Lys751Gln и XpC Lys939Gln на уровень хромосомных нарушений выявлено не было.

Таблица 1. Частота хромосомных нарушений в лимфоцитах с различными вариантами гена XpG Asp1104His.

Количество Доля клеток с Генотип аберраций на 100 хромосомными клеток аберрациями (%) XpG 5,25±0,28 5,15±0,27 Asp1104Asp XpG Asp1104His 5,76±0,38 5,58±0,37 6,35±0,50* XpG His1104His 6,49±0,53* *p0,05, отличие гомозигот по мутантному аллелю от гомозигот по аллелю дикого типа.

Обнаруженное в ходе проведенного исследования увеличение общей частоты хромосомных аберраций у лиц с генотипом XpG His1104His позволяет использовать этот генотип в качестве одного из маркеров для выявления группы лиц с повышенной токсико-генетической чувствительностью.

Работа поддержана грантами программы президиума РАН «Адаптация народов и культур к изменениям природной среды, социальным и техногенным трансформациям»; РФФИ № 07-04-96031-р_урал_а;

государственным контрактом Миннауки № 02.512.11.2233.

______________________________

1. Засухина Г.Д. // Генетика. – 2005. Т. 41. № 4. С. 520–535.

2. Costa R.M., Chigancas V., Galhardo R. S. et al. // Biochimie 2003. V. 85. P.

1083 – 1099.

3. Дружинин В.Г., Лифанов А.Ю., Головина Т.А. // Генетика. 1995. Т. 31 №

7. С. 983-987.

Научные руководители – д-р. биол. наук, проф. В. Г. Дружинин, канд.

биол. наук. В. И. Минина.

ГЕНЕТИКА БЛИЗНЕЦОВ В РЕСПУБЛИКЕ АЛТАЙ

О. Н. Ляшенко Горно-Алтайский государственный университет

Изучение близнецов имеет большое значение для генетики, для понимания роли наследственности и среды в образовании различных признаков человека и животных. Поэтому и говорят о «близнецовом методе» генетики для решения важных вопросов общей биологии, медицины, педагогики и животноводства.

Достоверными знаниями о близнецах стали располагать сравнительно недавно. По разным оценкам, сегодня в мире насчитывается от 70 до 80 миллионов пар близнецов. Чаще всего близнецов бывает двое, также зарегистрированы случаи неоднократного появления на свет трех, четырех и более близнецов. Исследования показали, что свыше 40% близнецовых беременностей заканчиваются на 38-й неделе, и свыше 50% близнецов по весу считаются недоношенными. Многие из них проводят первые недели жизни в «инкубаторах». Среди недоношенных детей близнецов в 6-8 раз больше.

Согласно мировой статистике рождение одной пары двойняшек в Норвегии, Дании и Нидерландах приходится на 49 родов, в США – на 60, во Франции, Испании и Италии – на 69, в Англии – на 76, в России – на 100, в Японии – на 150, а в Китае – на 250 родов. В России, а также и в Республике Алтай, как показали наши исследования, учащаются случаи рождения близнецов. В 2002 году в Республике Алтай зарегистрировано рождение 153 пары близнецов. В 2009 году рождение близнецов превысило показатель 2002 года на 47 пар близнецов, что составило 30,7%.

Выявлено, что все матери, родившие близнецов, были в возрасте 37-38 лет.

В экологически чистых районах республики, таких как Турочак, КошАгач, Шебалино и др., рождение близнецов встречается крайне редко.

Генетики Горно-Алтайска утверждают что, если будет ухудшаться экология, то возможен прирост рождения близнецов. Исследования продолжаются.

Научный руководитель – д-р биол. наук, проф. Т. А. Стрельцова.

ОРГАНИЗАЦИЯ РАЙОНОВ НЕДОРЕПЛИКАЦИИ В ГЕНОМЕ

DROSOPHILA MELANOGASTER

–  –  –

Удвоение эукариотических геномов происходит в определенное время в S-фазе клеточного цикла. Причем репликация разных участков хромосом может проходить в разное время. Это время для каждого района ДНК относительно постоянно в одном типе клеток, но может изменяться между разными клетками одного организма [1].

Время репликации участка ДНК зависит от его удаленности от ближайшего ориджина репликации, а так же времени, когда тот активируется в S-фазе. В то же время, неизвестно, для чего и в результате чего в клетке происходит временное и пространственное разделение репликации между разными районами ДНК. Понятно лишь, что их время репликации определяется не случайно, а является либо результатом, либо участником регуляции генетических процессов в клетке.

Удобным инструментом для исследования времени репликации служат политенные хромосомы слюнных желез дрозофилы. В результате развития клеток слюнной железы по типу эндоцикла, районы, в норме реплицируемые в конце, не полностью политенизированы (недореплицированы).

Ранее в геноме D. melanogaster были выявлены 52 района недорепликации [2], проявляющих признаки позднореплицируемой ДНК.

Целью данной работы являлось изучение геномной структуры этих районов. Было обнаружено, что для них характерны низкая плотность генов, длинные межгенные интервалы и обогащенность генами, экспрессирующимися преимущественно в семенниках D. melanogaster.

______________________________

1. Schwaiger, M., Stadler, M. B., Bell, O. et al. Chromatin state marks cell-typeand gender-specific replication of the Drosophila genome // Genes Dev.

2009. V. 23. P. 589-601.

2. Belyakin, S. N., Christophides, G. K., Alekseyenko, et al. Genomic analysis of Drosophila chromosome underreplication reveals a link between replication control and transcriptional territories // Proc. Natl Acad. Sci.

USA. 2005 V. 102, P. 8269-8274.

Научный руководитель – канд. биол. наук C. Н. Белякин.

ОЦЕНКА УРОВНЯ ГЕНОМНОЙ НЕСТАБИЛЬНОСТИ В

ОПУХОЛЕВОЙ И ПЕРИТУМОРОЗНОЙ ТКАНИ МОЛОЧНОЙ

ЖЕЛЕЗЫ

–  –  –

Нестабильность кариотипа является одним из основных свойств опухолевых клеток. Одним из основных методов исследования такого рода нарушений является микроядерный тест.

Объектом исследований служили мазки-отпечатки опухолевой и перитуморозной ткани лиц с раком молочной железы, проживающих на различных территориях Республики Беларусь (г. Гомель и г. Минск).

Препараты готовили по стандартной методике, с каждого препарата анализировали 1000 клеток, учитывая клетки с микроядрами.

Как следует из наших данных, частота встречаемости клеток с патологиями достоверно выше в опухолевой (Р 0,005) и перитуморозной (Р 0,01) тканях пациентов из г. Гомеля, чем из г. Минска.

По частоте встречаемости клеток с 1, 2, 3 микроядрами, общему количеству микроядер и клеток с микроядрами, образцы тканей рака молочной железы женщин проживающих в Гомеле значительно превосходят значения образцов, полученных от женщин, проживающих в Минске и Минской области, при этом различие статистически достоверно (клетки с 1 (1,469 ± 0,043 %), 2 (0,124 ± 0,013 %), 3 и более микроядрами (0,022 ± 0,005 %), – г. Гомель; в г. Минске (0,450 ± 0,027 %), (0,065 ± 0,010 %) и (0,008 ± 0,003 %), соответственно) (общий уровень микроядер (1,783 ± 0,047 %) г. Гомель и (0,594 ± 0,031 %) г. Минск).

При анализе фоновой ткани молочной железы также было выявлено статистически достоверное превышение частоты встречаемости клеток с микроядрами: клетки с 1 микроядром (0,608 ± 0,032 % в г. Гомеле и 0,178 ± 0,018 % в г. Минске), общее количество микроядер (0,715 ± 0,034 % в г. Гомеле и 0,182 ± 0,018 % в г. Минске), общее количество клеток с микроядрами (0,66 ± 0,033 % в г. Гомеле и 0,180 ± 0,018 % в г. Минске).

Таким образом, можно заключить, что показатели основного уровня мутагенеза образцов тканей из г. Гомеля статистически значимо превышают таковые в образцах из г. Минска. Обсуждаются возможные причины отмеченных различий с учетом дополнительного радиационного фактора, характерного для «чернобыльских» территорий.

Научный руководитель – д-р биол. наук, профессор С. Б. Мельнов.

СРАВНЕНИЕ ВОЗРАСТНЫХ ПРОФИЛЕЙ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ

VEGF И PEDF В СЕТЧАТЧЕ КРЫС OXYS И WISTAR

–  –  –

Линия крыс OXYS является уникальной моделью социально значимого заболевания – возрастной макулярной дегенерации (ВМД), которое занимает 3-е в мире и выходит на 1-е место в развитых странах как причина необратимой слепоты. Ранее мы показали, что, как и у людей, развитие ВМД у крыс OXYS связано с изменением экспрессии гена VEGF (vessel endothelial grow factor). В данной работе исследовались возрастные (20 дней., 3 мес., 12 мес., 17 мес., 24 мес.) изменения экспрессии генов VEGF и его антагониста PEDF (Pigment epithelium derived factor) (qRTPCR) в сетчатке крыс OXYS и контрольных Wistar для выяснения их взаимосвязи и вклада в патогенез ретинопатии. В 20 дн. признаков ВМД у крыс OXYS нет и не обнаружены межлинейные различия в экспрессии исследуемых генов. С возрастом экспрессия VEGF снижается в 5-10 раз (F9,39=13,33 p0,000), PEDF в 5 раза (F9,40=22,22 p0,000), но у крыс OXYS это происходит быстрее. Так уже в возрасте 3 месяцев экспрессия гена VEGF снижена ~10 раз (p0,000), а гена PEDF – втрое (0,009) в сравнении с 20 дневными и 3 мес.-крысами Wistar. В возрасте 24 мес.

экспрессия этих генов у крыс Wistar достоверно увеличивается и достигает половины уровня экспрессии 20 дн. животных (p0,0003). У OXYS такого повышения не наблюдается. В 3 месяца у крыс OXYS активно проявляются первые признаки ВМД. Как видно, это происходит при существенно сниженном уровне экспрессии генов VEGF и PEDF.

Предполагается, что гипоксия вносит существенный вклад в развитие ранних стадий ВМД. Недостаток VEGF в период активного роста (с 20 дн.

до 3 мес.) может приводить к недоразвитию сосудистого русла хориоидеи сетчатки, гипоксии и нарушению трофики. Известно, что PEDF обладает свойствами нейропротектора, поэтому его снижение может вносить вклад в гибель нейроретины от развивающейся ишемии. VEGF и PEDF экспрессируются преимущественно в клетках ретинального пигментного эпителия (РПЭ), и сочетанное изменение их экспрессии может свидетельствовать о наличии между этими факторами взаимнорегуляции или же о нарушениях функционального состояния РПЭ. В 24 месяца у крыс Wistar появляются первичные изменения сетчатки и можно предположить, что повышение экспрессии генов в этом возрасте является компенсаторной реакцией на них. У крыс OXYS же такая реакция, по неясным на сегодня причинам, нарушена.

Научный руководитель – д-р биол. наук Н. Г. Колосова.

ОСОБЕННОСТИ СТРОЕНИЯ ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ

ВАРИАБЕЛЬНЫЕ ДОМЕНЫ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ,

НАПРАВЛЕННЫХ К ОСНОВНОМУ БЕЛКУ МИЕЛИНА

А. Л. Матвеев, В. В. Морозова, Н. В. Тикунова Новосибирский государственный университет Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН В настоящий момент предполагают, что причины возникновения аутоиммунного заболевания многофакторны. Влияние внешней среды, нарушения работы иммунной системы и гормональной регуляции, а также генетическая предрасположенность играют большую роль в развитии аутоиммунного заболевания. В частности, важную роль играют инфекции.

Одним из распространенных аутоиммунных заболеваний является рассеянный склероз (РС), хроническое иммуновоспалительное заболевание, при котором, вследствие нарушений в работе иммунной системы, повреждается миелиновая оболочка нервных волокон. При этом в крови больного появляются антитела против основного белка миелина (МВР).

Показано, что в очагах воспалительной димиелинизации зачастую присутствуют герпесвирусы – Эпштейна-Барр и/или цитомегатовирус (CMV).

С целью исследования особенностей строения генов, кодирующих иммуноглобулины против МВР, из аутоиммунной библиотеки одноцепочечных антител человека были отобраны антитела против МВР. Эта библиотека была сконструирована на основе мРНК периферических лимфоцитов пациентов с PC и обогащена в ходе 4-х раундов биопэнинга с использованием МВР в качестве антигена. Из обогащенной библиотеки были отобраны 6 уникальных антител, специфически связывающих МВР.

После сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей Vh- и Vlгенов, кодирующих эти антитела, проведенного при помощи баз данных было показано значительное сходство нуклеотидной IgBLAST, последовательности Vh-гена одного антитела (56) и одного Vl-гена антитела (11а\12а) с соответствующими доменами антител против LMV 1 (latent membrane protein) EBV. Сходство составило 93 и 85 %, соответственно. Кроме того, у антитела 11а\12а отсутствовал третий гипервариабельный участок в Vh-домене.

ХАРАКТЕРИСТИКИ РАННИХ СТАДИЙ ОБРАЗОВАНИЯ

КЛЕТОЧНЫХ ГИБРИДОВ ОТ СЛИЯНИЯ ТЕТРАПЛОИДНЫХ

ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И ДИПЛОИДНЫХ

ЭМБРИОНАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ МЫШИ

–  –  –

Изучение природы такого свойства генома эмбриональных клеток, как плюрипотентность, является одной из важнейших задач современной биологии развития. Гибридные клетки между эмбриональными стволовыми клетками (ЭС клетки) и эмбриональными фибробластами (ЭФ) – эта удобная модель для изучения механизмов плюрипотентности. В таких клетках происходит взаимодействие плюрипотентного и соматического геномов; это дает информацию о взаимоотношении геномов клеток с различным происхождением.

Целью данной работы является изучение характеристик ранних стадий образования клеточных гибридов от слияния тетраплоидных ЭС клеток линии D3T7 и диплоидных ЭФ мышей линии DD/c. С этой целью проводили иммунофлуоресцентный анализ маркеров, характерных для плюрипотентного (Oct4, Nanog) и фибробластического (коллаген I-го типа) геномов, на ранних стадиях слияния (4 или 6, 8, 24 и 48 час. после слияния). Для идентификации гибридных клеток использовались флуоресцентный зеленый белок (GFP) и голубые флуоресцентные гранулы, маркирующие цитоплазму ЭС клеток и ЭФ, соответственно.



Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 |
Похожие работы:

«Негинская Мария Александровна МЕХАНИЗМЫ КАЛЬЦИЕВОЙ СИГНАЛИЗАЦИИ НЕЙРОНОВ И АСТРОЦИТОВ ПРИ ФОТОДИНАМИЧЕСКОМ ВОЗДЕЙСТВИИ РАДАХЛОРИНА Специальность – 03.01.02 Биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Воронеж – 2017 Работа выполнена в Академии биологии и биотехн...»

«Скамрова Галина Борисовна КОМБИНИРОВАННОЕ ДЕЙСТВИЕ СЛАБОГО МИКРОВОЛНОВОГО ИЗЛУЧЕНИЯ И ДНК-СВЯЗЫВАЮЩИХСЯ ПРЕПАРАТОВ НА КЛЕТКИ БУККАЛЬНОГО ЭПИТЕЛИЯ ЧЕЛОВЕКА Специальность 03.01.02 – Биофизика Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор физико-математических наук, про...»

«Ковалева Вера Дмитриевна ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ NO-ЗАВИСИМЫХ СИГНАЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ В УСТОЙЧИВОСТИ НЕЙРОНОВ И ГЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК К ФОТОДИНАМИЧЕСКОМУ ПОВРЕЖДЕНИЮ Специальность – 03.01.02 Биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук...»

«МУНИИПАЛЬНОЕ АВТОНОМНОЕ ОБЩЕОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ЛИЦЕЙ №7 г.ТОМСКА Сценарий открытого урока английского языка в 8 классе по теме “GLOBAL ISSUES” Лазарева С.В., учитель английского языка МАОУ лицея №7 г.Томска Технологическая карта урока английского языка в 8 классе Тема: “Global issu...»

«ISSN 2518-1629 (Online), ISSN 2224-5308 (Print) АЗАСТАН РЕСПУБЛИКАСЫ ЛТТЫ ЫЛЫМ АКАДЕМИЯСЫНЫ сімдіктерді биологиясы жне биотехнологиясы институтыны ХАБАРЛАРЫ ИЗВЕСТИЯ NEWS НАЦИОНАЛЬНОЙ АКАДЕМИИ НАУК OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН OF...»

«Негинская Мария Александровна МЕХАНИЗМЫ КАЛЬЦИЕВОЙ СИГНАЛИЗАЦИИ НЕЙРОНОВ И АСТРОЦИТОВ ПРИ ФОТОДИНАМИЧЕСКОМ ВОЗДЕЙСТВИИ РАДАХЛОРИНА Специальность: 03.01.02 – Биофизика Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор А. Б....»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ КАРАЧАЕВО-ЧЕРКЕССКОЙ РЕСПУБЛИКИ XIII КАРАЧАЕВО ЧЕРКЕССКАЯ РЕСПУБЛИКАНСКАЯ ОТКРЫТАЯ НАУЧНОДАР» КРАЕВЕДЧЕСКАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ НАУЧНОГО ОБЪЕДИНЕНИЯ УЧАЩИХСЯ (ДЕТСКАЯ АКАДЕМИЯ РАЗВИТИЯ) СЕ...»

«ПРЕЗЕНТАЦИЯ НА ТЕМУ ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ГРУППЫ РАСТЕНИЙ ПО ОТНОШЕНИЮ К АБИОТИЧЕСКИМ ФАКТОРАМ. ПОДГОТОВИЛА СУХАНОВА МАРИЯ 11 А КЛАСС ЯНВАРЬ 2016Г. ФАКТОРЫ • 1) АБИОТИЧЕСКИЕ (СВЕТ, ВОДА, ТЕМПЕРАТУРНЫЙ РЕЖИМ) • 2) ЭДАФ...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФГАОУ ВО Новосибирский национальный исследовательский государственный университет Факультет естественных наук УТВЕРЖДАЮ Декан ФЕН НГУ, профессор _ Резников В.А. «_29_»августа 2014 г. Экологическая...»

«ISSN 2224-5308 АЗАСТАН РЕСПУБЛИКАСЫ ЛТТЫ ЫЛЫМ АКАДЕМИЯСЫНЫ ХАБАРЛАРЫ ИЗВЕСТИЯ NEWS НАЦИОНАЛЬНОЙ АКАДЕМИИ НАУК OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН OF THE REPUBLIC OF KAZAKHSTAN БИОЛОГИЯ ЖНЕ МЕДИЦИНА СЕРИЯСЫ СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ И МЕДИЦИНСКАЯ SERIES OF BIOLOGICAL AND MEDICAL 1 (...»

«ПРАКТИКУМ ПО БИОЛОГИЧЕЕСКОЙ ЗАЩИТЕ РАСТЕНИЙ С ОСНОВАМИ ОБЩЕЙ ЭНТОМОЛОГИИ СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ Раздел I. ОСНОВЫ ОБЩЕЙ ЭНТОМОЛОГИИ (6) Тема 1. МОРФОЛОГИЯ, АНАТОМИЯ И БИОЛОГИЯ НАСЕКОМЫХ (6) 1.1. Морфология насекомых (6) 1.2. Анатомия насекомых (16) 1.3. Жизненные циклы насекомых (21) Контрольные вопросы (26)...»

«Управление образования администрации Старооскольского городского округа Муниципальное образовательное учреждение дополнительного образования детей «Центр эколого – биологического образования»УТВЕРЖДЕНА: РАССМОТРЕНА РАССМОТРЕНА муниципальным на заседании педагогического Приказом директора экспертным советом упр...»

«ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА Рабочая программа составлена на основе Примерной программы основного общего образования по биологии с учетом авторской программы А.Г.Драгомилова, Р.Д. Маш по курсу « Человек и его здоровье». Структура курса складывается из трех частей. В первой раскрывается биосоциальная природа человека, определяется его место в...»

«Башмаков Виктор Юрьевич БИОХИМИЧЕСКАЯ И ЭКСПРЕССИОННАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ПУТЕЙ РАЗОБЩЕНИЯ ДЫХАНИЯ И ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ДИАБЕТЕ И СВЕТЛОКЛЕТОЧНОМ РАКЕ ПОЧКИ Специальность 03.01.04 – биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель докто...»








 
2017 www.pdf.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - разные матриалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.