WWW.PDF.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Разные материалы
 

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

«МАТЕРИАЛЫ XLVII МЕЖДУНАРОДНОЙ НАУЧНОЙ СТУДЕНЧЕСКОЙ КОНФЕРЕНЦИИ «Студент и научно-технический прогресс» 12–15 апреля 2009 г. БИОЛОГИЯ ...»

-- [ Страница 3 ] --

В Тюменском Кардиологическом центре было обследовано 132 человека трудоспособного возраста, которые были разбиты на 2 группы:

1- больные с АГ, контроль (70 мужчин, 29 женщин);

2-больные с АГ и ЗЩЖ (14 мужчин, 19 женщин).

Для оценки достоверности различий средних значений использовали критерий Стьюдента. Исследование липидного состава крови больных производили на приборе EOS BRAVO LICG 897 (пр-во Hospitex Diagnostics, Италия) по следующим параметрам: уровень холестерина, липопротеидов высокой плотности (ЛПВП), липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) и триглицеридов.

При оценке результатов в обеих группах не было выявлено достоверных различий в концентрации холестерина и ЛПНП, а также ЛПВП у женщин. Одновременно наблюдаются относительно низкие показатели уровня ЛПВП у мужчин с АГ и ЗЩЖ по сравнению с группой контроля.

Достоверные различия обнаруживаются при оценке уровня триглицеридов: и у женщин, и у мужчин с АГ и ЗЩЖ наблюдается повышенная концентрация триглицеридов по сравнению с контрольной группой.

Таким образом, в ходе исследования показано, что сочетание АГ с ЗЩЖ приводит к изменению липидного спектра крови.

Научный руководитель – канд. биол.наук, доц. О. Н. Лепунова

АНАЛИЗ АССОЦИАЦИИ ПОЛИМОРФНЫХ ВАРИАНТОВ ГЕНОВ ФОЛАТНОГО ЦИКЛА С ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТЬЮ К

РАЗВИТИЮ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ В ЗАПАДНОСИБИРСКОМ РЕГИОНЕ РОССИИ.

–  –  –



Метаболизм фолатов является важным звеном клеточного метаболизма: производные фолиевой кислоты поставляют одноуглеродные фрагменты для таких жизненно важных процессов, как регенерация метионина, превращение уридинмонофосфата в тимидинмонофосфат, биосинтез пуриновых нуклеотидов, метилирование ДНК. Гены фолатного цикла могут быть рассмотрены в качестве генов-кандидатов развития онкологических заболеваний, поскольку недостаточное метилирование ДНК может приводить к инактивации протоонкогенов и нарушению хромосомной сегрегации, а подавление синтеза тимидилата – к ошибочной встройке dUMP и повреждению ДНК.

Целью нашей работы являлось изучение роли аллельных вариантов генов фолатного цикла C677T и A1298C гена MTHFR (метилентетрагидрофолатредуктазы), А66G гена MTRR (редуктазы метионин-синтазы), G1258A гена MTHFD (метилентетрагидрофолатдегидрогеназы), T833C/844INS68 гена CBS (цистатионин--синтазы) и A2756G гена MTR (метионин-синтазы) в формировании предрасположенности к развитию рака молочной железы.

Определение полиморфных вариантов генов MTHFD и CBS проводилось методом ПЦР-ПДРФ анализа, а генов MTHFR, MTRR и MTR - методом ПЦР в режиме реального времени с использованием конкурирующих TaqMan-зондов, комплиментарных полиморфной последовательности ДНК.

И в контрольной, и в экспериментальной группах распределение генотипов для всех исследуемых полиморфных локусов соответствовало распределению Харди-Вайнберга. Нами не было выявлено статистически значимых различий частоты встречаемости аллелей или генотипов полиморфных локусов исследуемых генов между контрольной группой и группой больных раком молочной железы. Полученные нами результаты могут говорить о том, что данные полиморфизмы не оказывают влияние на развитие рака молочной железы в Западно-Сибирском регионе России.

Научные руководители – Е. Н. Воронина, канд. биол. наук У. А. Боярских.

ИССЛЕДОВАНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ НА ОСНОВЕ РАСТЕНИЙ ЯКУТИИ





<

–  –  –

К биологически активным веществам относятся ферменты, витамины, гормоны и эфирные масла. Эфирные масла образовываются исключительно в различных частях растений, ввиду своих физиологических и фармакологических свойств применяются в качестве регуляторов роста растений, в борьбе сорняками, в ароматерапии, в качестве антисептиков и в профилактике различных заболеваний человека.

Связь изучения обилия и распространенности эфирномасличных растений на территории тундровой и таежной зоны Якутии с практическим применением продуктов выделения как эфирные масла в агрофитоценозах, в профилактике заболеваний является актуальной задачей. Объектом исследования представлены эфирномасличные растения Artemisia jacutica L., Achillea millefolium L., Ledum palustre L., Thymus bitominosus Klok, Schizonepeta multifida (L.) Brig., Pinus pumila (Pall.) Regel, собранные на территории Амгинского, Мегино-Кангаласского, Хангаласскаго и Оймяконского районов Якутии. В первую очередь была составлена карта обилия произрастания популяций данных видов растений [1]. В условиях маршрутно-стационарных исследований произведены геоботанические описания фитоценозов Центральной, Южной Якутии и Северо-Восточной части Якутии. В лабораторных условиях методом парофазной перегонки выделены эфирные масла для исследования их биологического активного начала в качестве стимуляторов роста культурных растений, ингибиторов роста сорных видов растений [2]. Заложены опыты для изучения антибактериальной активности эфирных вытяжек Artemisia jacutica L., Pinus pumila L. и Ledum palustre L.

_____________________________________________________________

1. Оценка обилия эфирно-масличных растений таежной и тундровой зоны Якутии // Научный отчет НИР №СО263 ФЦП Интеграция. М.: 2002.

– 224 с.

2. Разработка и реализация препаратов эфирного масла с активным биологическим началом на основе полыни якутской в качестве средств для защиты растений от сорняков // Научный отчет НИОКР Госконтракта №5700р/8381. М.: 2009. – 10 с.

Научный руководитель – канд. биол. наук, доц. Ж. М. Охлопкова

ВЛИЯНИЕ ЖАСМОНОВОЙ КИСЛОТЫ И ЗЕЛЕНОГО СВЕТА

РАЗНЫХ ИНТЕНСИВНОСТЕЙ НА МОРФОГЕНЕЗ АРАБИДОПСИСА

<

–  –  –

Гормональная система растений представляет собой сложный комплекс регуляторных механизмов. Особенности действия многих фитогормонов мало изучены, примером является жасмоновая кислота (ЖК), хотя доказательства ее гормональной природы были получены более 20 лет назад.

Жасмонаты, прежде всего, являются сигнальными молекулами в быстрых ответах на абиотические и биотические стрессы. Известно, что ЖК действует как ингибитор, подобно абсцизовой кислоте и этилену, и как индуктор роста, подобно ауксину. Кроме вышеперечисленных функций, есть предположение, что ЖК может быть вовлечена в передачу светового сигнала в качестве вторичного посредника. Показано пересечение путей передачи ауксина, жасмоната и светового сигнала в клетках растения на нескольких уровнях (Kazan and Manner, 2008).

В более ранних исследованиях было отмечено взаимодействие красного и синего света с жасмоновой кислотой. Однако участие ЖК в передаче зеленого света (ЗС) не рассматривалось.

Модельным объектом послужил Arabidopsis thaliana (L.) Heynh дикого типа Columbia (Col) и полученные на его основе мутанты axr1-3, с нарушенным передачей сигнала в ответ на ауксины, и jar1-1, мутант с нарушенной работой фермента, модифицирующего ЖК. В работе использовали ЗС низкой интенсивности (2.7, 4.0 и 4.7 мкмоль/м 2с).

Морфометрические исследования проростков, выросших в темноте, показали, что длина гипокотиля мутантов axr1-3 и jar1-1 была достоверно меньше, а длина корня и площадь семядолей больше, чем у дикого типа Col. Экзогенная жасмоновая кислота (10-6 М) вызывала укорочение размеров осевых органов и увеличение площади семядолей у всех линий. Но, при этом, степень ответа jar1-1 была ниже, так как у этого мутанта нарушен ответ на ЖК. Ингибирующее действие зеленого света в отношении гипокотилей проявлялось как у дикого типа, так и у мутантов. Площадь семядолей с увеличением интенсивности освещения повышалась только у мутантов. При совместном действии зеленого света и жасмоновой кислоты реакция мутантов в отношении длины гипокотиля отличалась. Так, зеленый свет (4 мкмоль/м2с) усиливал ингибирующее влияние ЖК на гипокотили axr1-3 и снимал действие ЖК в отношении проростков jar1-1.

Таким образом, жасмоновая кислота включается в передачу сигнала зеленого света низких интенсивностей.

Работа поддержана грантом РФФИ (грант 08-04-90042-Бел_а).

Научный руководитель - канд. биол. наук М.В. Ефимова.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЛАКТОФЕРРИНА ЧЕЛОВЕКА С ОЛИГОСАХАРИДАМИ И НЕСПЕЦИФИЧЕСКИМИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДАМИ

<

–  –  –

Лактоферрин (ЛФ) – полифункциональный белок из семейства трансферринов. Этот гликопротеин с молекулярной массой около 80 кДа широко представлен в различных секреторных жидкостях организма, в плазме крови и в наибольшей концентрации в молоке. Лактоферрин относится к белкам неспецифического иммунитета, он участвует в защитных реакциях и регулирует функции иммунокомпетентных клеток. Белок взаимодействует с ДНК и РНК, полисахаридами, гепарином. Число различных биологических функций, обнаруженных у белка, постоянно возрастает. Для понимания возможных причин исключительной полифункциональности ЛФ необходимо детальное изучение процесса взаимодействия белка с такими жизненно важными молекулами, как ДНК и РНК.

Целью данной работы являлось исследование ферментативных свойств лактоферрина при взаимодействии его с олигонуклеотидами и олигосахаридами.

В ходе работы впервые был проведен детальный анализ влияния неспецифических олигодезоксирибонуклеотидов ( d(pN) n ) на комплексообразование ЛФ со специфическим олигонуклеотидом (TAGAAGATCAAA).

Показано, что белок эффективно взаимодействует с 8–10 звеньями неспецифического олигонуклеотида, расположенными в пределах белковой глобулы. Увеличение длины неспецифических d(pN)n на одно звено приводит к возрастанию их сродства к белку в 1.932.35 раза за счет аддитивных контактов фермента с различными структурными элементами олигонуклеотидов. Основной вклад в сродство одноцепочечных олигонуклеотидов к ЛФ вносят слабые электростатические взаимодействия. При исследовании амилолитической активности было показано наличие у лактоферрина двух центров, обладающих олигосахарид-гидролизующей активностью, при этом более реакционноспособный находится в N-концевой части молекулы.

Научный руководитель – канд. хим. наук С. Е. Соболева.

БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА КНЯЖИКА

СИБИРСКОГО ATRAGENE SIBIRICA L.

В. Б. Дубина Институт биологии, экологии, почвоведения, сельского и лесного хозяйства Томский Государственный Университет В последнее время большое внимание уделяется поиску и изучению средств растительного происхождения, как потенциальных источников новых лекарственных средств, отличающихся малой токсичностью, мягкостью действия и отсутствием побочных эффектов в отличие от синтетических аналогов. Одним из таких перспективных лекарственных средств растительного происхождения является княжик сибирский Atragene sibirica L.

Исследования последних лет показали, что биологически активные вещества (БАВ) княжика сибирского обладают ноотропным действием. Были проведены химико-фармакологические исследования и разработано новое высокоэффективное ноотропное средство Сибирским Государственным Медицинским университетом, совместно с НИИ фармакологии Томского НЦ СО РАМН.

В ходе данной работы в экстракте княжика сибирского были выявлены следующие группы БАВ: фенолкарбоновые кислоты, кумарины, антраценпроизводные, флавоноиды и фенолоспирты.

Количественное содержание фенолкарбоновых кислот в различных органах варьирует в пределах 1.0-3.7 %; кумаринов 1.7-2.2 %;

антраценпроизводных 0.7-0.9 %, флавоноидов 0.3-0.5 %. Вследствие качественного и количественного изучения фенольного комплекса, показано, что листья содержат 3.3, стебли 1.6, а семена 0.6 % фенолоспиртов.

По результатам количественного содержания БАВ в томском образце княжика сибирского можно говорить о возможности использования его в качестве растительной базы для создания фармпрепарата ноотропного действия с последующим введением его в культуру in vitro.

Научный руководитель – д-р хим. наук Л. Н. Зибарева

ВЛИЯНИЕ СТРУКТУРЫ ДНК И ФЕРМЕНТА НА УЗНАВАНИЕ

ПОВРЕЖДЕННЫХ ОСНОВАНИЙ 8-ОКСОГУАНИН-ДНКГЛИКОЗИЛАЗАМИ ЧЕЛОВЕКА И E. COLI

–  –  –

Одним из самых распространенных окисленных оснований ДНК является 8-оксогуанин. Репарация этого повреждения идет по пути эксцизионной репарации оснований (ЭРО) с участием 8-оксогуанин-ДНК-Nгликозилазы (OGG1) у эукариот или формамидопиримидин-ДНК-Nгликозилазы (Fpg) у прокариот. Обладая практически полностью перекрывающимися субстратными специфичностями, эти ферменты имеют различные первичную и третичную структуры.

Конформационная комплементарность между молекулами ДНК и фермента, а также жесткость молекулы ДНК входят в число главных факторов, определяющих эффективность узнавания субстрата ДНК-зависимыми ферментами. В связи с этим была исследована активность ферментов OGG1 и Fpg в реакции расщепления ДНК-субстратов, отличающихся конформационными параметрами и нуклеотидным контекстом, а также изучен вклад отдельных структурных доменов белка Fpg в специфическое фермент-субстратное взаимодействие.

В ходе данной работы было показано, что присутствие неканонических пар, фланкирующих поврежденное основание с двух сторон, значительно увеличивает значение KM. Наличие только одной фланкирующей неканонической пары или пар с двух сторон по типу «качания» ведет лишь к небольшому росту KM.

Жесткая структура субстрата в области контакта с ферментом может увеличивать не только значение KM, но и kcat. При анализе ферментативных свойств изолированного C-концевого домена Fpg (C-Fpg) обнаружена AP-лиазная активность, установлены оптимальные условия для ее проявления. Определены кинетические параметры APлиазной реакции, катализируемой C-Fpg. Показано образование промежуточного ковалентного комплекса C-Fpg с ДНК в ходе реакции. Обнаружена нуклеазная активность белка C-Fpg в присутствии ионов Mg2+.

Научный руководитель – д-р биол. наук Д. О. Жарков.

ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ СИЛИКАТНЫХ БАКТЕРИЙ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ

А. А. Жигмитов Восточно-Сибирский государственный технологический университет Несмотря на большую распространенность в природе силикатные бактерии в настоящее время еще малоизучены, хотя актуальность и перспективность их исследования не вызывает сомнений.

Поэтому на первом этапе главным является выделение и изучение морфолого-физиологических и биологических свойств чистой культуры силикатных бактерий. В данной работе представлены результаты выделения и изучения морфологии бактерий, обладающих силиказной активностью. В работе использовали общепринятые в микробиологии методы и селективные среды.

Естественным местом обитания силикатных бактерий является почва, лишайники и др., из которых их можно выделить путем высева на безазотистую агаризованную среду. На безазотистых средах силикатные бактерии образуют характерные колонии. Они выпуклые, округлой формы, с ровными краями, слабоокрашенные в кремовый цвет, совершенно прозрачные имеют тягучую консистенцию, с трудом отделяются от субстрата.

Эти характерные признаки внешнего вида колоний позволяют их выделить в чистую культуру. Морфологически клетки представлены палочковидными клетками, окрашиваются по Граму положительно, образуют споры, капсулы, подвижны. Предварительно данную культуру отнесль к роду Bacilus. По отношению к кислороду – аэробы, хорошо растут при 37оС, при рН 6-7, не разжижают желатину. Способность образовывать капсулу сохраняют не только при росте на безазотистых средах, но на МПА.

В настоящее время изучение физиологических и биологический свойств выделенных бактерий продолжается Научный руководитель – канд. биол. наук, доц. Е. Г. Инешина.

КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ПАРАМЕТРОВ КРОВИ И МОЧИ У БЕРЕМЕННЫХ ЖЕНЩИН С УРОГЕНИТАЛЬНЫМИ ПАТОЛОГИЯМИ

–  –  –

На фоне снижения рождаемости, проблема ведения беременности у женщин с экстрагенитальной патологией приобретает первостепенную значимость и актуальность. Беременность следует рассматривать как экстремальное физиологическое состояние женского организма. Функционирование ряда органов и систем организма во время беременности протекает на грани патологи, причем меняются критические сроки, когда легко наступает срыв, декомпенсация той или иной системы или органа [1].

Урогенитальные инфекции являются частыми заболеваниями, как в амбулаторной, так и в стационарной акушерско–гинекологической практике. Возбудителями этих инфекций является широкий круг различных микроорганизмов: Chlamydia trachomatis, Mycoplasma spp., Ureaplasma urealyticum, Neisseria gonorrhoeae. Внутриутробное инфицирование плода грозит развитием морфологических изменений, которые могут приводить к патологии беременности и плода [2].

Целью исследования явилось изучение общеклинических и биохимических показателей крови и мочи беременных женщин, в различные сроки гестационного периода, с урогенитальными инфекциями. Исследование проводилось на базе ГЛПУ ТО «Перинатального центра» (г. Тюмень).

Клиническая лабораторная диагностика крови и мочи является простейшим, но максимально информативными исследованием [3].Изучаемые параметры выявляют факторы риска, отклонения от нормального течения беременности, а значит, позволяют сохранить здоровье матери и ребенка, осуществить благополучные роды и обеспечить нормальное развитие ребенка после его рождения.

______________________________

4. Савельева, Т.М. Беременность / Т.М. Савельева [и др.]:- М., 1976. с.

5. Бодяжина, В.И. Акушерство / В.И. Бодяжина, И.Б. Семенченко. Ростов – н /Д.: Феникс, 2004. – 480 с.

6. Ананьева, О.В Полный справочник акушера – гинеколога. / О.В Ананьева, М.В. Дрангой, Ю.В Михайлова. – М.: Эксмо, 2006. -736 с.

Научный руководитель – канд. биол. наук, доц. О.В. Фролова

НУКЛЕАЗНЫЕ АКТИВНОСТИ АНТИТЕЛ КРОВИ АУТОИММУННЫХ МЫШЕЙ ЛИНИИ MRL-LPR/LPR

–  –  –

Природные каталитически активные антитела обнаружены в крови пациентов с аутоиммунными патологиями: астмой, системной красной волчанкой (СКВ), полиартритом, тиреоидитом Хашимото, рассеянным склерозом, а также гепатитом, лейкемией и ВИЧ–заболеваниями, сопровождающимися тяжелыми поражениями иммунной системы.

Наиболее удобной моделью для детального изучения причин спонтанного и индуцированного проявления и развития аутоиммунных заболеваний (АИЗ), приводящих к наработке абзимов, являются мыши с генетической предрасположенностью к таким заболеваниям, например, мыши линии MRL, у которых вследствие дефектного белка гена fas происходит спонтанное развитие симптомов СКВ.

Цель настоящей работы заключалась в исследовании гетерогенности ферментативных свойств антител (АТ), гидролизующих нуклеиновые кислоты, индуцированных иммунной системой мышей линии MRL-lpr/lpr после спонтанного развития у них симптомов СКВ.

Проведено разделение АТ на ДНК-целлюлозе и исследована ферментативная активность отдельных фракций с различным сродством к ДНК.

Показано, что ДНКазная активность АТ является Me2+-зависимой. Ионы Mg2+, Mn2+ и Ca2+ активировали АТ, но по-разному влияли на относительную активность разных фракций после хроматографии.

Установлено, что основным иммуногеном при развитии аутоиммунных реакций является не сама ДНК, а ее комплексы с белками. Показано, что в зависимости от фракции АТ, элюированной с ДНК-целлюлозы, бычий сывороточный альбумин и его метилированный аналог активируют, ингибируют или не влияют на активность АТ.

Показано, что в зависимости от фракции АТ гидролизуют РНК с большей, примерно такой же или меньшей эффективностью, чем ДНК. Определены величины константы скорости (kcat) и константы Михаэлиса (KM) реакции гидролиза r(pC)10.

Полученные данные свидетельствуют о гетерогенности пула ДНКабзимов, образующихся при спонтанном развитии СКВ у мышей: 1) по сродству к ДНК, 2) относительной активности в гидролизе ДНК и РНК, 3) зависимости от ионов металлов и 4) эффективности взаимодействия с белками.

Научный руководитель – д-р биол. наук В. Н. Бунева.

ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ РАЗВИТИЯ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО СИНДРОМА У ЖИТЕЛЕЙ

ЗАПАДНО-СИБИРСКОГО РЕГИОНА

Е. А. Кудрявцева Институт химической биологии и фундаментальной медицины СОРАН Новосибирский государственный университет Метаболический синдром многофакторное заболевание, которое в большинстве случаев проявляется лишь тогда, когда выражено влияние факторов окружающей среды. В последние годы активно изучаются генетические факторы развития метаболического синдрома.

Целью данной работы является исследование роли аллельного полиморфизма генов FTO, INSIG2, ADRB3, GNB3, ApoA5, PPAR и TCF7L2 в генетической предрасположенности при развитии метаболического синдрома у жителей Западно-Сибирского региона.

Определены частоты встречаемости аллелей и генотипов данных полиморфных локусов в выборке здоровых жителей города Новосибирска, а также больных МС. Частоты встречаемости генотипов для всех исследуемых полиморфных локусов соответствовали закону Харди-Вайнберга.

Не обнаружено статистически значимых различий между частотами встречаемости аллелей и генотипов полиморфных локусов rs4994 гена ADRB3 (Arg64Trp), rs5443 гена GNB3 (С825Т), rs7901695 гена ТСF7L2, rs8050136 гена FTO и rs3135506 гена APOA5 (Ser19Trp) в группах больных МС и контрольной.

Аллель G полиморфного локуса rs3135506 гена ApoA5 ассоциирован с увеличением уровня ТГ (OR = 2.080, C.I.=[1.020-4.244], p=0.04012) у мужчин.

Аллель С полиморфного локуса rs7566605 гена INSIG2 является фактором риска развития МС (OR=1.738, p=0.01477), висцерального ожирения (OR=1.516, C.I.=[1.029-2.235], p=0.03471), высокого ИМТ (OR=1.609, C.I.=[1.041-2.488], p=0.03124), а также нарушений в липидном спектре (повышение уровня холестерина (OR=1.678, C.I.=[1.087-2.589], p=0.01849) и ТГ(OR=1.547, C.I.=[1.010-2.370], p=0.04388), снижение уровеня ЛПВП(OR=1.537, C.I.=[1.035-2.281], p=0.03219) у женщин. У мужчин аллель С данного полиморфного локуса ассоциирован только с повышением уровня ТГ плазмы (OR=1.896, C.I.=[1.000-3.597], p=0.04691) и холестерина (OR=1.918, C.I.=[1.073-3.428], p=0.02596).

Аллель С полиморфного локуса rs1801282 гена PPAR является фактором риска развития МС (OR = 9.541, p = 0.00109) Научный руководитель – м. н. с. Воронина Елена Николаевна

–  –  –

Г. Н. Кулмамбетова Евразийский национальный университет имени Л. Н. Гумилёва Низкомолекулярные метаболиты являются стимуляторами многих биохимических процессов бактерий. К ним относят соединения, которые выделяются клетками бактерий в окружающую среду и стимулируют рост популяции. Предположение о существовании подобных соединений было высказано ещё в трудах Л. Пастера, а их систематическое изучение началось после того, как О. Rahn (1906) в опытах с бактериями показал, что на ранних стадиях роста культур в среду культивирования выделяются особые соединения, способствующие сокращению лаг-фазы. Нередко на молочных предприятиях наблюдаются случаи снижения активности молочнокислого процесса, а именно из главных показателей контроля качества – активности кислотообразования. Проблема изменения молочнокислого процесса вследствие повышения или снижения кислотообразующей активности привлекает внимание, как учёных, так и практиков, ведущих исследования на производстве.

Основываясь на методах измерения кислотности, с добавлением различных фракций метаболитов, выделяемых бактериями в среду, был проведён анализ влияния низкомолекулярных метаболитов на активность кислотообразования. Объектами исследования являлись штаммы молочнокислых бактерий, выделенных из различных источников с разных регионов Казахстана и идентифицированных как вид Lactobacillus casei. Идентификация проводилась генетическим методом секвенирования. Фракции низкомолекулярных метаболитов были получены ультрафильтрацией культуральной жидкости бактерий на разных стадиях роста культуры.

Полученные данные свидетельствуют о том, что в первые часы культивирования бактерий, когда плотность клеток низкая, вырабатываются низкомолекулярные соединения, служащие сигнальными молекулами для ускорения роста и увеличения продукции кислот в культуре, а также соответствующих метаболитов. При высокой плотности, вырабатываются низкомолекулярные соединения, оказывающие ингибирующее действие на рост клеток и продукцию кислот.

Исследования по изучению регуляции и процесса кислотообразования низкомолекулярными соединениями у бактерий рода Lactobacillus выполнены впервые.

Научный руководитель – канд. биол. наук, доц. З. А. Аликулов.

–  –  –

П. П. Лактионов Институт цитологии и генетики СО РАН Новосибирский государственный университет Ведущая роль в реакциях иммунного ответа принадлежит лейкоцитам.

Регуляция эффекторных функций лейкоцитов осуществляется благодаря интеграции разнонаправленных сигналов, поступающих от поверхностных рецепторов. Выяснение роли отдельных рецепторов в балансе регуляторных сигналов имеет важнейшее значение для создания методов коррекции и управления иммунным ответом. Данная работа направлена на исследование функций рецептора SLAMF9. Трансмембранный рецептор SLAMF9 относится к CD2 семейству лейкоцитарных рецепторов, которые участвуют в регуляции функций всех типов лейкоцитов. Данный рецептор не исследован на белковом уровне и его сигнальные свойства неизвестны. На основании особенностей строения SLAMF9 мы предполагаем, что он способен ассоциировать с трансмембранными активирующими белками и, следовательно, выступать в роли активирующего рецептора. Наличие активирующих свойств у SLAMF9 рецептора может быть причиной противоречий в in vivo и in vitro экспериментах, указывающих на существование сложной сети межклеточных взаимодействий, в которой рецепторы CD2семейства оказывают дифференциальный эффект на различные типы клеток. В результате работы были впервые получены данные о способности SLAMF9 ассоциировать с трансмембранными активирующими белками DAP12, FcRg, TCRz.

Научный руководитель – канд. биол. наук С. В. Гусельников

ВЛИЯНИЕ СИНЕГО СВЕТА НА МОРФОГЕНЕЗ ГЕНЕТИЧЕСКИ

МОДИФИЦИРОВАННЫХ РАСТЕНИЙ ARABIDOPSIS THALIANA

(L.) HEYNH

–  –  –

В настоящее время в мире получено большое количество генетически модифицированных растений, однако их физиология в настоящее время исследуется недостаточно. Интеграция фрагмента ДНК в случайный участок генетического аппарата растений может изменить экспрессию соседних или далеко отстоящих генов, в результате чего физиологические процессы изменятся (Карначук и др., 2008).

Одним из важных физиологических факторов является свет, который выполняет не только энергетическую роль в фотосинтезе, но и контролирует рост и развитие растений (Воскресенская, 1979).

В работе были использованы генетически модифицированные растения A. thaliana с введенным чужеродным геном (gusA) под контролем промотора гена первичного ответа на цитокинин (ARR5) и исходная родительская линия экотип Wassilewskija (N-тип) (D’Agostino et al., 2000). Используемые трансформированные растения отличались друг от друга степенью экспрессии гена - ARR5 low (с низким уровнем экспрессии) и ARR5 high (с высоким уровнем экспрессии генов). В работе использовали синий свет низкой интенсивности (1.0, 2.8 и 3.2 мкМ/м 2с).

При изучении морфогенеза 7-суточных проростков A. thaliana в темноте обнаружили различия ростовых показателей арабидопсиса N-типа и трансформированных растений. Показано, что длина корня и площадь семядолей трансгенных проростков были меньше, чем у проростков N-типа, различий в длине гипокотилей у изучаемых линий не обнаружено.

Реакцией проростков A. thaliana на синий свет, как N-типа, так и трансгенных растений было уменьшение длины гипокотиля и увеличение длины корня и размеров семядолей. Причем увеличение площади семядолей у проростков N-типа и трансгенной линии ARR5 low было более значительным, по сравнению с проростками ARR5 high. Также показано, что, с увеличением интенсивности света с 2,8 до 3,2 мкМ/м 2с площадь семядолей трансформированных проростков уменьшалась.

Таким образом, показано, что внедрение «чужеродного» фрагмента ДНК влияет на морфологию проростков Arabidopsis в темноте и изменяет степень ответа на синий свет.

Авторы выражают благодарность проф., д-р биол. наук Р.А. Карначук и проф., д-р биол. наук В.В. Кузнецову за помощь в проведении работы.

Работа поддержана грантом РФФИ (грант 09-04-90741-моб_ст).

Научный руководитель - канд. биол. наук М.В. Ефимова.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ БРАССИНОСТЕРОИДОВ И ЗЕЛЕНОГО

СВЕТА НА НАЧАЛЬНЫХ ЭТАПАХ МОРФОГЕНЕЗА A. THALIANA

–  –  –

Растения воспринимают свет в качестве источника энергии для фотосинтеза и как сигнал, активирующий и изменяющий программы внутреннего развития. Фотоморфологическое действие света на растение реализуется через систему рецепторов и вторичных мессенджеров, одними из которых являются фитогормоны.

Среди регуляторов роста имеется группа фитогормонов, обладающая высокой биологической активностью – брассиностероиды (БС). Основными сферами их применения является стимуляция роста и развития растений, улучшение условий для процессов генеративного развития, повышение продуктивности, устойчивость к неблагоприятным факторам внешней среды и улучшение качества сельскохозяйственной продукции. Предполагается участие БС в фотоморфогенезе, в качестве регуляторных молекул.

Недостаток этого гормона приводит к экспрессии свето-регулируемых генов в темноте, в то время как у обычных растений эти гены экспрессируются только на свету.

Удобным модельным объектом для изучения регуляторной роли БС в фотоморфогенезе служат растения A. thaliana, для которого получены мутанты по фоторецептору CRY1 (hy4) и с нарушениями в биосинтезе БС (det2).

Исследования этиолированных проростков A. thaliana показали, что длина гипокотилей и площадь семядолей hy4, были достоверно меньше, чем у дикого типа Ler. Мутант det2 отличался от дикого типа Col более укороченным гипокотилем, а также бльшей площадью семядолей.

Зеленый свет (ЗС, =532 нм, 29 мкмоль/м2с) активировал программу фотоморфогенеза у проростков дикого типа и мутантов. Это выражалось в укорочении осевых органов родительской линии Col и увеличении площади семядолей мутанта det2. Деэтиоляция ЗС ингибировала растяжение гипокотилей и стимулировала рост семядолей у дикого типа Ler и мутанта hy4.

Экзогенные брассиностероиды (брассинолид, гомобрассинолид и эпибрассинолид, 10-8 М) стимулировали удлинение гипокотиля у det2 и подавляли его рост у Col, Ler и hy4, при этом площадь семядолей увеличивалась как у диких типов, так и у мутантов.

При одновременном действии БС и ЗС площадь семядолей значительно увеличилась по сравнению с действием этих факторов по-отдельности.

Таким образом, показана физиологическая активность зеленого света и БС в регуляции морфогенеза арабидопсиса на ранних стадиях онтогенеза.

Работа поддержана грантом РФФИ (грант 08-04-90042-Бел_а).

Научный руководитель - канд. биол. наук М.В. Ефимова.

–  –  –

Известно, что внеклеточная ДНК (внДНК) отличается от геномной ДНК по составу ДНК-последовательностей. Однако то, насколько концентрация отдельных фрагментов внДНК коррелирует с концентрацией тех же фрагментов в геномной ДНК в настоящее время не известно, хотя данные об относительной представленности внДНК необходимы для понимания как механизмов генерации внеклеточных нуклеиновых кислот, так и их потенциального биологического действия. Целью работы являлось изучение относительного содержания различных последовательностей геномной ДНК в составе внеклеточной ДНК в культуре клеток человека с помощью метода флуоресцентной гибридизации in situ (FISH).

Для получения ДНК-зондов были использованы Degenerate Oligonucleotide Primed - ПЦР (DOP-ПЦР) и Linker Adapter - ПЦР (LA-ПЦР). В ходе получения ДНК-библиотек методом LA-ПЦР геномную ДНК гидролизовали при помощи эндонуклеаз MseI или RsaI и НаеIII, с последующим лигированием двуцепочечных адаптеров и амплификацией полученных ДНК-библиотек. В результате анализа полученных ДНК-библиотек при помощи FISH-анализа было показано, что гидролиз геномной ДНК эндонуклеазами рестрикции RsaI/HaeIII приводит к селективной амплификации эухроматиновых районов хромосом, в то время как при гидролизе ДНК эндонуклеазой рестрикции MseI равномерно амплифицируются все районы хромосом, и несколько более эффективно - прицентромерные районы. ДНК-зонды, полученные при помощи метода DOP-ПЦР из внДНК, связанной с поверхностью первичных фибробластов и клеток HeLa, были проанализированы при помощи метода двухцветного FISH-анализа. На основе анализа профилей флуоресценции для хромосом 1, 13, 14, 15, 19 и Y-хромосомы было показано, что внеклеточная ДНК, связанная с поверхностью клеток HeLa, не отличается от клеточной. В результате анализа состава внДНК первичных фибробластов было показано, что в пуле внДНК более представлен прицентромерный район 19 хромосомы и менее представлены дистальные части p-плеча акроцентрических хромосом 13, 14 и 15. Таким образом, было показано, что внДНК трансформированных клеток не отличается от геномной, а внДНК, связанная с поверхностью первичных фибробластов, отличается по составу от геномной ДНК.

Научные руководители – д-р биол. наук проф. Н. Б. Рубцов, канд. биол.

наук П. П. Лактионов.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АТФ-СИНТАЗЫ В КАЧЕСТВЕ БИОЛОГИЧЕСКОГО НАНОМОТОРА

–  –  –

Фермент АТФ-синтаза предназначен для синтеза или гидролиза молекул АТФ, а также для переноса протонов (Н+) через мембрану клетки, чем обеспечивает стабильный внутриклеточный рН цитоплазмы. Установлено, что при гидролизе АТФ одна из частей фермента совершает вращательное движение.

АТФ-синтаза состоит из двух отдельных частей: F0 - гидрофобной части, связанной с мембраной, ответственной за транспорт протонов, и F1 гидрофильной части, ответственной за синтез и гидролиз АТФ [1].

По мере того как протоны протекают через F0-часть энзима, субъединица части F1-ATФ-синтазы вращается по часовой стрелке и идет синтез АТФ. Гидролиз АТФ происходит при вращении -субъединицы против часовой стрелки; при этом направление протекания протонов меняется на обратное. Субъединицы «a, b, и c» части F0-АТФ-синтазы формируют канал переноса протонов через клеточную мембрану. Места катализа и присоединения нуклеотидов обнаружены на трех «а» и трех «b»

субъединицах части F1-ATФ-синтазы. -субъединица расположена в центре гексамера 33 и вращается при синтезе или гидролизе АТФ [2].

Фермент АТФ-синтаза работает аналогично обычному электродвигателю: ротор вращается внутри неподвижного статора. Тем самым АТФсинтаза представляет собой полную аналогию макроскопических моторов, сделанных человеком, которые также состоят из ротора и статора.

При попытке интегрирования природного наномотора в НЭМСсистему, путем присоединения к нему флуоресцентной микросферы диаметром 1 мкм к -субъединице АТФ-синтазы, удалось измерить радиальное отклонение микросферы при вращении субъединицы.

При добавлении к набору биологических моторов 2 мM Na 2ATФ и при присутствии в растворе 4 мM MgC2 дифференциальным интерферометром наблюдалось вращение микросферы, составляющее 9.5-10.5 Гц, или 3-4 об/сек. Причем вращение представляло собой дискретные изменения угла, образованного -субъединицей и 33-комплексом, каждый раз на 120°.

Важнейший недостаток моторов данного типа - малая степень управляемости [1]. То есть, если использовать АТФ-синтазный мотор для управления наноманипулятором, задать перемещение ротора в 10-20° будет практически невозможно, так как дискретность работы мотора - 120°.

Конечно, существует теоретическая возможность воспользоваться редукторами и прочими преобразователями движения, но это усложнит конструкцию и увеличит размер устройства. Также один из недостатков работы данного биомотора - условие работы в жидкой среде, что существенно ограничивает их круг применения.

Дальнейшие исследования в этой сфере должны быть направлены на изучение инженерных свойств АТФ-синтазы и производительности этого фермента. Это необходимо для дальнейшей разработки функционирующих наномеханических устройств, приводимых в движение F1-АТФсинтазой. Нужно, например, определить зависимость производительности мотора, как обобщенную функцию, от теплоотдачи, выхода протонов, рН, загрузки фермента молекулами АТФ. Более того, необходимо изучить взаимодействие между субъединицами и 33, чтобы в будущем методами протеиновой инженерии улучшить производительность мотора, если это будет возможно.

По эффективности работы и развиваемой АТФ-синтазой силе она существенно превосходит все известные в природе молекулярные моторы [2]. Так, например, молекула АТФ-синтазы приблизительно в 10 раз сильнее актомиозинового комплекса, выполняющего сократительные функции в мышцах и других органах организма.

На основе АТФ-синтазы возможно создание и применение биологического наномотора в различных наноконструкциях, состав которых будет состоять преимущественно из биологических молекул, что заметно будет упрощать возможность интеграции данного мотора в эту конструкцию.

Так как на данный момент, возможность совмещения биологических и неорганических элементов в механизмах нанометрового масштаба не существует.

Данный биологический мотор как нельзя лучше подходит по характеристикам для современных исследований в области нанобиотехнологий. В течение следующих 10-15 лет альтернативы биологическим моторам не предвидится [3].

5. Bhushan B. Nanotechnology. Springer, 2007.-1916 p.

Khler M., Fritzsche. Nanotechnology: an introduction to nanostructuring techniques. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, 2007.

Montemagno C. Nanotechnology: сonstructing Biological Motor Powered 7.

Nanomechanical Devices. New-York Publishers GmbH, 1999.

Научный руководитель – канд. биол. наук, проф. Г. Шоне.

МЕХАНИЗМЫ, ПРИВОДЯЩИЕ К ПОЯВЛЕНИЮ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В КУЛЬТУРЕ

КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА

–  –  –

Такие процессы как апоптоз и некроз, которые приводят к появлению ДНК во внеклеточной среде, не могут быть источником роста концентрации внеклеточных ДНК (внДНК) в культуре активно пролиферирующих и/или стимулированных к пролиферации клеток. За исключением апоптоза, процессы, которые могут приводить к появлению внДНК в живых клетках, практически не изучены.

Целью представленной работы является изучение механизмов появления внДНК в культурах первичных и онкотрансформированных клеток человека. При помощи мультиплексной TaqMan-ПЦР LINE1-элементов и альфа-сателлитного повтора (СП) было исследовано влияние стимуляции клеток липополисахаридом (ЛПС) и ингибиторов секреции на концентрацию свободной и связанной с поверхностью клеток внДНК.

Было показано, что зависимость концентрации внДНК от времени инкубации имеет разный характер в культурах первичных и трансформированных клеток: если в культуре первичных клеток максимальная концентрация внДНК наблюдается между 5 и 8 часами, то в культуре клеток аденокарциномы концентрация внДНК выходит на плато после 8 часов культивирования. Отношение концентрации LINE1-элементов к концентрации СП (LINE1/СП) во внДНК отличаются от геномной, причем в нестимулированных клетках это отношение выше в свободных внДНК, а после стимуляции ЛПС-ом отношение LINE1/СП в связанных внДНК становится выше, чем в свободных внДНК. Активация первичных эндотелиоцитов бактериальным липополисахаридом приводит к двукратному повышение концентрации ДНК в культуральной среде и снижению концентрации внДНК, связанной с поверхностью клеток. Обработка стимулированных клеток ингибитором Гольджи-зависимой секреции (монензин) уменьшает концентрацию внДНК на 45%.

Данные о нехарактерном для генома количественном соотношении LINE1 и СП повторов во внДНК свидетельствуют о селективности процессов ее генерации. Ингибирование монезином ЛПС индуцированного роста концентрации внДНК свидетельствует о том, что по крайней мере часть внДНК появляется не в результате апоптоза, а за счет активной секреции клетками.

Научный руководитель – канд. биол. наук П. П. Лактионов

–  –  –

По отношению к экстрацеллюлярным протеиназам, количество выделенных и изученных внутриклеточных ферментов несравнимо мало.

Это связано не только со сложностью разрушения клеточной стенки бацилл, но и с меньшей стабильностью внутриклеточных белков.

Был подобран оптимальный метод разрушения клеток Bacillus intermedius 3-19 с целью получения максимального количества внутриклеточных белков. Было проведено сравнение трёх методов разрушения клеток бацилл: механическое растирание с абразивом, ферментативное разрушение (обработка лизоцимом), воздействие ультразвука.

Для ферментативного разрушения клеточную массу смешивали с буферным раствором Tris-HCl (0,015М, рН7,5), содержащим 0,3% KCl и лизоцим (2мг/мл). Полученную смесь инкубировали в течении 30 мин. при 37°С, центрифугировали 15 мин при 10 тыс.об/мин. Количество внутриклеточных белков в супернатанте – 2,62 мг/мл. Микроскопирование осадка показало наличие неразрушенных протопластов. По-видимому, лизоцим не оказывает влияния на цитоплазматическую мембрану клеток, что не позволяет внутриклеточным белкам перейти в раствор. Данный метод необходимо сочетать с механической или ультразвуковой обработкой.

Растирание клеток проводили, смешивая клеточную массу с буферным раствором Tris-HCl (0,015М, рН7,5), содержащим 0,3% KCl, и добавляя абразив. После обработки смесь центрифугировали. Содержание белка в супернатанте – 5 мг/мл. Недостатками метода являются высокая трудоемкость и длительность обработки.

Воздействию ультразвука подвергали суспензию клеток (10%) в буферном растворе Tris-HCl (0,01М). Буфер варьировал по значениям рН (8,0 и 9,0), а так же содержанию лизоцима (0 и 1 мг/мл). Обработку проводили в течении 1 мин. Наиболее полное разрушение клеток (количество экстрагированного белка – 19,1 мг/мл) наблюдалось в условиях рН8,0 и в присутствии лизоцима. Увеличение времени ультразвукового воздействия приводило к снижению количества белка в клеточном экстракте.

Научные руководители – канд. биол. наук Е. О. Михайлова, канд. биол.

наук, доц. А. М. Марданова.

СЕРИНОВЫЕ ПРОТЕИНАЗЫ BACILLUS INTERMEDIUS

–  –  –

Экстрацеллюлярные протеолитические ферменты, относящиеся к клану субтилизинов, выделены из многих представителей рода Bacillus. В то же время, внутриклеточные ферменты этого клана исследованы только у нескольких бацилл: B.amyloliquefaciens, B.licheniformis и B.subtilis.

Объект нашего исследования - внутриклеточные сериновые протеиназы Bacillus intermedius 3-19. Грубый клеточный экстракт получали путем ультразвуковой обработки клеток, выращенных на жидкой питательной среде в течение 16 часов. Специфическую активность субтилизиноподобных сериновых протеиназ определяли с помощью синтетического субстрата Z-Ala-Ala-Leu-pNa. Наличие данной активности в экстракте определяли качественно, через 16 часов после начала реакции. Низкая активность внутриклеточных протеиназ связана, возможно, с наличием специфических ингибиторов.

Были проведены начальные этапы очистки ферментов с использованием ДЭАЭ- и КМ-целлюлозы. Очистка ферментов при помощи КМцеллюлозы не дала положительных результатов, поскольку белки не адсорбировались на носителе. В эксперименте использовали буферный раствор ацетата натрия (0,015М, рН6,2). По-видимому, для очистки внутриклеточных протеиназ с помощью данного носителя необходимо использование буферных растворов с более высоким значением рН.

При очистке белков с помощью ДЭАЭ-целлюлозы был использован буферный раствор Tris-HCl (0,01М, рН8,0). Элюцию проводили ступенчато, методом повышения ионной силы раствора при увеличении концентрации хлорида натрия: 0,1М, 0,3М, 0,5М. Были получены три пика элюции, в каждом из которых наблюдалась общая протеолитическая, а так же специфическая активность. Общую протеолитическую активность определяли относительно казеина. Величина удельной специфической активности была максимальна во фракции, полученной при элюции буферным раствором, содержащим 0,3М NaCl. На электрофореграмме данной фракции, видно, что препарат фермента не гомогенен.

В качестве второго этапа очистки внутриклеточных сериновых протеиназ Bacillus intermedius предполагается проведение высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием колонки Mono Q – сильного анионообменника.

Научные руководители – канд. биол. наук Е. О. Михайлова, канд. биол.

наук, доц. А. М. Марданова.

–  –  –

Вирус папилломы человека высокого онкогенного риска является по данным МАИР ВОЗ этиологическим фактором рака шейки матки. В России по частоте встречаемости лидирует ВПЧ 16 типа, однако эти данные касаются, в основном, европейской и центральной части России. Практически неизвестна обстановка по распространенности ВПЧ в регионах Сибири и Дальнего Востока.

Целью работы явилось определение общей инфицированности, частоты встречаемости ВПЧ высокого канцерогенного риска и вирусной нагрузки среди вирус–позитивных женщин с патологией шейки матки различного генеза в популяции Томского региона и республики Тыва.

В исследовании приняли участие 191 женщина Томского региона (средний возраст 33.1±0.8 года), среди них: здоровые, n =19, женщины с фоновыми патологиями шейки матки(ФПШМ), n=146, группа с дисплазиями I-III, n=9, больные РШМ I-IV, n=17; 81 пациентка р. Тыва (средний возраст 43.3 ±1.2 года), среди них: здоровые, n =19, женщины с ФПШМ, n=43, больные РШМ I-IV, n=19. Работа проводилась с использованием технологии Real-Time PCR, для статистической обработки данных применяли точный критерий Фишера.

При исследовании общей инфицированности ВПЧ показано, что из 191 жительницы Томского региона ДНК ВПЧ была выявлена у 87 человек (45.5%), из 81 р. Тыва - у 41 человека (50.6 %). При исследовании распределения вирусной нагрузки среди ВПЧ(+) лиц показано, что в группе здоровых женщин Томской области вирус в клинически значимых концентрациях выявлялся в 21% случаев, с ФПШМ – в 26%, с дисплазиями – в 55.5%*, с РШМ - в 70.6%* **(различия достоверны: *- с группой здоровых, ** – с группой ФПШМ, р0,05) и среди женщин р. Тыва в 15.8% в группе здоровых женщин, в группе с ФПШМ – 27.9% и 52.6% в группе больных РШМ.

Показано, что лидирующим по частоте встречаемости в обеих регионах является ВПЧ16 (27.4% и 37.7%). Среди женщин Томского региона менее распространены ВПЧ56 (11.3%), ВПЧ52 (9.1%), ВПЧ31 (8.5%), ВПЧ33/51 (7.7%). Среди женской популяции р. Тыва на втором месте по частоте встречаемости оказался ВПЧ18 (16.3%), другие же типы – в порядке убывания – ВПЧ31(13.1%), ВПЧ56(8.2%), ВПЧ35/45(4.9%) и другие реже, чем в 3.3%.

Научный руководитель – д-р биол. наук Л. Н. Уразова.

ИЗУЧЕНИЕ ГЕНА RCL У ГИПЕРТЕНЗИВНЫХ КРЫС НИСАГ И

НОРМОТЕНЗИВНЫХ КРЫС WAG

–  –  –

Для изучения стресса как фактора, провоцирующего развитие гипертонии, в ИЦиГ СО РАН была получена линия крыс с наследуемой индуцируемой стрессом артериальной гипертензией (НИСАГ). По данным гибридизации макрочипов Atlas rat stress array, (BD Biosciences, Clontech, USA) одним из генов, экспрессия которых достоверно различалась у гипертензивных крыс НИСАГ и нормотензивных крыс WAG, является ген putative c-Myc-responsive (Rcl). Экспрессия гена Rcl была в 2,5 раза ниже в надпочечниках и почках у крыс НИСАГ по сравнению с крысами WAG.

Были проанализированы первичные структуры кодирующей части кДНК гена Rcl у крыс НИСАГ и WAG. Были найдены 3 синонимичные замены у обеих исследуемых нами линий по сравнению с последовательностью из базы данных GenBank. Согласно базе данных GenBank известно 2 варианта 3’нетранслируемых областей (3'UTR) последовательности гена Rcl, использующихся в разных тканях. Были изучены последовательности 3’UTR гена Rcl в тканях печени, почек и легких крыс WAG и НИСАГ.

Впервые показано, что в мРНК гена Rcl в изученных тканях крыс WAG и НИСАГ синтезируется два варианта 3'UTR. Межлинейных различий в использовании 3’UTR в тканях крыс двух линий выявлено не было. С помощью программы «Andvisio» было проанализировано возможное взаимодействие гена Rсl с генами, ассоциированными с гипертонией и построена генная сеть. Экспрессия гена Rcl прямо стимулируется протоонкогеном с-Мyc [1], а рецептор ангиотензина II типа AT1 может запустить клеточное деление, репликацию в сердечно-сосудистой системе и повысить уровень экспрессии протоонкогенов (c-fos, c-myc and c-jun) [2]. Таким образом, различный уровень экспрессии гена Rcl может играть важную роль в развитии гипертензии у крыс НИСАГ.

Работа поддержана грантами РФФИ № 08-04-01048 и Министерства науки и образования РФ № 3H-319-09.

7. Lewis BC, Shim H, Li Q, Wu CS, Lee LA, Maity A, Dang CV.

(1997) Identification of putative c-Myc-responsive genes:

characterization of rcl, a novel growth-related gene. Mol Cell Biol., 17(9): 4967-78.

8. Rosendorff C. (1996) The renin-angiotensin system and vascular hypertrophy. J Am Coll Cardiol. 28(4): 803-12 Научный руководитель – канд. биол. наук O. E. Редина

ИЗУЧЕНИЕ ШТАММОВ ВИРУСА БОЛЕЗНИ НЬЮКАСЛА, ВЫДЕЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ РФ ОТ ДИКИХ ПТИЦ.

–  –  –

Болезнь Ньюкасла является одним из серьезнейших заболеваний птиц, способным вызывать крупные падежи, причиняя огромный вред сельскому хозяйству и нанося серьезный экономический ущерб. Болезнь Ньюкасла это вирусное заболевание, которое вызывается вирусом болезни Ньюкасла (далее – ВБН), естественным резервуаром которого являются дикие птицы.

Вспышки болезни Ньюкасла регулярно регистрируются по всему миру. В настоящее время систематический мониторинг ВБН у диких птиц на территории РФ отсутствует. Считается, что для защиты от этого инфекционного возбудителя вполне достаточно вакцинации птиц на птицефабриках и крупных птицефермах. В небольших частных хозяйствах птицы зачастую не вакцинируются, что повышает опасность возникновения эпизоотий при передаче вирулентного штамма от диких птиц домашним.

В настоящее время ВБН достаточно эффективно контролируется вакцинацией и массовыми забоями птицы, но, тем не менее, он представляет потенциальную угрозу для коммерческой и домашней птицы, подтверждением чему служат вспышки в Австралии (Westbury, 2001), Корее (Youn Jeong Lee, 2004) и Калифорнии (Janice C., Pedersen, 2004), вызвавшие крупные падежи домашней птицы. Новые вирулентные варианты ВБН могут быть занесены на территорию РФ перелетными птицами.

В связи с этим представляется необходимым изучение штаммов ВБН циркулирующих на территории РФ и близлежащих государств, а так же комплексный анализ выделенных штаммов.

В ходе работы было исследованно14 изолятов ВБН. Для выделеных изолятов ВБН были определены нуклеотидные последовательности Сконцевого сегмента М-гена и N-концевого сегмента F-гена. Так же был проведен филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей Nконцевого сегмента F-гена выделенных изолятов. На основании полученных результатов 11 штаммов были отнесены к классу 2, 2 – к классу 1, 1 – к вирусам голубей. На основании аминокислотной последовательности сайта расщепления белка слиянии 1 изолят был охарактеризован как патогенный.

Научные руководители - канд. биол. наук А. М. Шестопалов, Н. Ю.

Силко.

АНАЛИЗ ЦИРКУЛЯЦИИ ВИРУСА ГРИППА ТИПА А В ПОСТЭПИЗООТИЧЕСКИЙ ПЕРИОД НА ТЕРРИТОРИИ ЧАНОВСКОЙ

ОЗЕРНОЙ СИСТЕМЫ В 2008 г.

–  –  –

Вирус гриппа рода А (Influenzavirus A) принадлежит к семейству Ортомиксовирусов (Ortomyxoviridae). Вирус гриппа А имеет широкий круг хозяев, включающий различные виды млекопитающих и птиц.

Штаммы вируса классифицируют на субтипы на основании антигенных свойств двух поверхностных гликопротеинов вирусной частицы – гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA). К настоящему моменту только у штаммов вируса гриппа А с субтипами Н5 и Н7 известны как высокопатогенные, так и низкопатогенные варианты, Дикие птицы водно-болотной экологической группы являются основным природным резервуаром вируса гриппа А, откуда он проникает в популяции сельскохозяйственных птиц. Миграции птиц способствуют распространению различных вариантов этого вируса на огромные расстояния.

Поэтому для контроля над возбудителем необходим мониторинг и изучение вариантов вируса, циркулирующих в популяциях птиц диких биоценозов, изучение их генетических, патогенных и антигенных свойств позволит оценить эпизоотическую опасность таких вариантов.

Другим важным аспектом изучения вируса гриппа А является выяснение филогенетических связей штаммов, выделенных от птиц разных регионов, что позволит изучить пути географического распространения вируса в природном резервуаре.

В период 30-31.08.2008г. на территории Чановской озерной системы проводился забор клоакальных смывов у диких птиц. Из 255 собранных проб 24.71% оказались положительными. Для идентификации вируса гриппа А была проведена полимеразная цепная реакция с парами праймеров, специфичными к генам M и NP, и для определения субтипа изолятов вируса гриппа А – с парами субтипспецифичных праймеров. Из полученных положительных проб в 27.14% было выявлено наличие вируса гриппа А.

Научный руководитель- канд. биол. наук А.М. Шестопалов

СОДЕРЖАНИЕ СЕЛЕНА В ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЯХ

НА ПРИМЕРЕ КИПРЕЯ УЗКОЛИСТНОГО (CHAMAERION

ANGUSTIFOLIUM (L.) HOLUB)

–  –  –

Селен (Se) представляет собой физиологически важный микроэлемент, незаменимый в питании человека и животных. Основной биологической ролью селена является его участие в синтезе и активности антиоксидантных ферментов. Актуальность изучения содержания селена в лекарственных растениях несомненна, так как недостаточность селена в питании приводит к развитию микроэлементозов человека и животных. Одним из самых распространенных лекарственных растений является кипрей узколистный, применяемый при воспалении уха, горла, носа. Водный настой из листьев рекомендован при язвенной болезни желудка, гастритах и колитах.

Целью данной работы является анализ содержания селена (Se) в лекарственных растениях на примере кипрея узколистного (Chamaerion angustifolium (L.) Holub).

Сбор материала проводился летом 2007–2008 гг. в окрестностях городов Якутска и Олекминска РС (Я). В биопробах определяли суммарное содержание селена флуориметрическим методом.

Согласно литературным источникам самое низкое содержание Se в травянистых растениях большей части территории Земли составляет 0,08мг/кг. В некоторых работах приводятся данные, что концентрация селена в травянистых растениях варьирует от 0,006 до 1 мг/кг. В целом территория Якутии относится к селенодефицитным районам. По результатам наших исследований содержание Se в кипрее узколистном так же минимально (табл. 1).

Таблица 1 Содержание микроэлемента Se в кипрее узколистном Участок сбора Содержание Se, мг/кг Якутск 0,0096±0,3 Олекминск 0,0087±0,2* Примечание: * - статистическая достоверность при p0,05 Таким образом, кипрей узколистный не является растениемконцентратором Se.

Научный руководитель - канд. биол. наук, Я.Б. Легостаева.

ВЛИЯНИЕ СИНТЕТИЧЕСКИХ АНАЛОГОВ МАЛЫХ ЯДРЫШКОВЫХ C/D бокс РНК НА СПЛАЙСИНГ пре-мРНК

–  –  –

Малые ядрышковые РНК в комплексе с белками обеспечивают посттранскрипционную модификацию различных РНК в клетках эукариот. По наличию консервативных элементов в нуклеотидной последовательности из многочисленной группы малых ядрышковых РНК выделяют семейство C/D бокс РНК. РНК этого семейства направляют сайт-специфичное метилирование рибозы по 2’-OH группе в нуклеотидах рРНК- и малых ядерных РНК. C/D бокс РНК содержат одну или две области узнавания мишени, фланкированные С (RUGAUGA) и D (CUGA) боксами.

Целью данной работы является исследование влияния аналогов C/D бокс РНК на сплайсинг пре-мРНК в культуре клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7. Были сконструированы аналоги U24 C/D бокс РНК, содержащие две области узнавания мишени. Первая область направляла 2'-O-метилирование нуклеотидов пре-мРНК белка теплового шока hsc70: аденозина – точки разветвления сплайсинга, донорного и акцепторного сайтов сплайсинга, первого и последного нуклеотидов интрона. Второй антисмысловой участок направлял 2'-O-метилирование G1702 18S рРНК. Сконструированные РНК были получены с помощью транскрипции in vitro T7 РНК-полимеразой синтетических ДНК матриц. Было установлено, что трансфекция клеток MCF-7 синтетическими аналогами C/D бокс РНК, сопровождаемая мягким тепловым шоком, приводит к 2`О-метилированию целевого G1702 в рРНК. В этих же условиях наблюдается нарушение сплайсинга пре-мРНК и образование продуктов альтернативного сплайсинга. Так, в случае C/D бокс РНК, направленных на аденозин – точку разветвления сплайсинга и акцепторный сайт сплайсинга, нарушения выражались в возникновении формы с исключением экзона, лежащего за целевой точкой разветвления сплайсинга, либо содержащего целевой акцепторный сайт сплайсинга.

В перспективе, на основе способности C/D бокс РНК направлять модификации в пре-мРНК-мишени, тем самым влияя на экспрессию генов, возможна разработка терапевтических средств противораковой терапии.

Научный руководитель – канд. хим. наук Д. В. Семенов

АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЕГИДРОГЕНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ МУКОРОВОГО ГРИБА BLAKESLEA

TRISPORA

–  –  –

Определение дегидрогеназной, липазной и фитазной активности каротинсинтезирующих грибов в последнее время вызывает все большую заинтересованность исследователей из разных стран мира. Для определения дегидрогеназной активности Blakeslea trispora была разработана методика с использованием метиленового синего.

Метиленовый синий блокирует дыхательную цепь передачи электронов, вытесняя из нее структурно подобные аналоги — цитохромы. Поскольку дыхательная активность на протяжении жизненного цикла клетки меняется, постепенно угасая, то и интенсивность блокирования дыхательной цепи метиленовой синью будет разной.

Результаты экспериментов по определения дегидрогеназной активности в пробах инокулята, отобранных из маточных колб и посевных аппаратов позволили прийти к следующим выводам:

1. Разнополые штаммы Blakeslea trispora желательно выращивать на протяжении разных сроков: “плюс” форму – 24-29 часов, а “минус” форму

– на протяжении 40-56 часов.

2. Такая разница в сроках выращивания разнополого инокулята характерна для штаммов, полученных методом классической селекции, для штаммов к которым применили GS-селекцию, эта тенденция не подтвердилась — дозревание “+” и “–” штаммов у них происходит более синхронно — на протяжении 29-32 часов. Это значительно облегчает работу с этими штаммами и повышает их технологичность.

3. Физиологически активный мицелий окрашивается метиленовым синим в светло-голубой цвет неодинаковой интенсивности.

4. Физиологически активный инокулят находится в экспоненциальной фазе развития (ІІ фаза роста)

5. Мицелий, который имеет высокую дегидрогеназную активностью, более быстро обесцвечивается на свету, и приобретает серо–бежевый цвет.

6. Популяция клеток в закрытой емкости является гетерогенной. При отстаивании в пробирках инокулят расслаивается так, что физиологически активный мицелий с высокой дегидрогеназной активностью всплывает, а более молодой, недозрелый мицелий оседает на дно.

Бесспорными преимуществами этого метода является простота выполнения, экспресность, невысокая стоимость реагентов.

Научный руководитель - канд. биол. наук, доц. И.В. Бондарь.

–  –  –

Эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы, ЭР) представляют собой сайтспецифические ДНК-эндонуклеазы бактерий. ЭР, относящиеся к IIA или IIS типам узнают непалиндромные последовательности ДНК и производят гидролиз обеих цепей внутри или рядом с сайтом узнавания [1]. Такие рестриктазы являются составной частью систем рестрикции-модификации (РМ-систем), в которые помимо них входят одна или две ДНКметилтрасферазы (метилазы), защищающие ДНК бактерии от гидролиза собственной ЭР. Данная работа посвящена обнаружению и изучению РМсистемы BspACI, имеющей сайт узнавания 5’-CCGC-3’.

Был обнаружен бактериальный штамм Bacillus species AC, являющийся продуцентом новой рестриктазы BspACI. Фермент выделяли из штамма с помощью трех стадий хроматографии. Используя специальносинтезированные олигонуклеотиды, определили позицию гидролиза узнаваемой последовательности изучаемой ЭР: 5’-CCGC-3’/3’-GGCG-5’.

Таким образом, новая ЭР является истинным изошизомером рестриктазы AciI [2]. Исследовали зависимость степени гидролиза от наличия С5метилцитозинов в сайте узнавания рестриктазы BspACI. Для этого провели гидролиз двух плазмид, несущих гены метилаз, M.Fsp4HI и M.HspAI и сконструировали теоретические картины гидролиза этих плазмид при различных вариантах блокирования расщепления наличием метильных групп в узнаваемой последовательности. Кроме того, провели гидролиз олигонуклеотидов, несущих метильную группу на одном из цитозинов, входящих в сайт узнавания. Полученные данные по гидролизу плазмид и олигонуклеотидов полностью коррелируют друг с другом.

1. Pingoud A. and Jeltch A. Structure and function of type II restriction endonucleases Structure and function of type II restriction endonucleases // Nucleic Acid Res. – 2001. – Vol. 29. – P.

3705-3727.

2. Polisson C. and Morgan R. AciI, a unic restriction endonuclease from Arthrobacter citreus which recognizes 5’ CCGC 3’ // Nucleic Acid Res. – 1990. – Vol. 18. – P. 5911.

Научные руководители – д-р биол. наук, проф. С. Н. Загребельный, канд. биол. наук Д. А. Гончар.

ИЗУЧЕНИЕ ФНО-СВЯЗЫВАЮЩЕГО БЕЛКА ВИРУСА НАТУРАЛЬНОЙ ОСПЫ В КАЧЕСТВЕ НОВОГО СРЕДСТВА ДЛЯ АНТИЦИТОКИНОВОЙ ТЕРАПИИ

–  –  –

Гиперпродукция фактора некроза опухолей (ФНО) приводит к ряду заболеваний человека (ревматоидный артрит и др.). Новым классом ФНОблокаторов могут стать препараты на основе ФНО-связывающего белка CrmB вируса натуральной оспы (ВНО). Одним из этапов исследования CrmB ВНО в качестве лекарственного средства для антицитакиновой терапии было определение иммуногенности данного белка.

Иммуногенность рекомбинантного белка CrmB ВНО, проверяли относительно рекомбинантного белка A30L ВНО, обладающего высоким показателем по данному параметру. Проводили 4 иммунизации мышей. При определении специфичности и титра сывороток, полученных после иммунизаций, методами ИФА и Вестерн-блот анализа впервые показано, что белок CrmB ВНО активирует синтез специфичных антител с большей эффективностью по сравнению с эффективностью активирования синтеза антител белком A30L без адьюванта Фрейнда, и несколько уступает активированию синтеза антител белком A30L с адьювантом Фрейнда. Высокая иммуногенность может быть связана с мультимеризацией белка. Ранее было показано, что ФНО-нейтрализующей активностью обладают преимущественно олигомерные формы CrmB ВНО, а в случае белка CrmB вируса оспы коров (ВОК) - димерные формы.

У белка CrmB выделяют PLAD-домен, домен связывающий ФНО и SECRET-домен, связывающий хемокины. Впервые выполнена работа по созданию методами генетической инженерии нескольких рекомбинантных белков, сконструированных из функциональных доменов белков CrmB ВНО и CrmB ВОК. Получены рекомбинантные плазмиды, содержащие нуклеотидные последовательности генов CrmB ВНО и CrmB ВОК и их химерных и делеционных вариантов. Ожидается, что полученные белки утратят способность к олигомеризации и будут обладать пониженной иммуногенностью относительно CrmB ВНО, но при этом сохранят способность эффективно связывать ФНО.

Работа выполнена при поддержке мэрии г. Новосибирска (договор 19Научный руководитель – канд. биол. наук Т. С. Непомнящих

ВЛИЯНИЕ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ АЗОСПИРИЛЛ

НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ СПЛЕНОЦИТОВ

А.А. Фомина1, А.C. Бойко2 1Саратовский государственный университет им. Н.Г.Чернышевского 2Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН В настоящее время большое внимание уделяется поиску новых природных иммуномодулирующих веществ, среди которых перспективны липополисахариды (ЛПС) грамотрицательных бактерий, в силу большого разнообразия их строения. Важным показателем, по которому можно судить о иммунотропных и митогенных свойствах препаратов, является пролиферация клеток. В связи с этим целью данной работы явилось исследование in vitro пролиферативного ответа спленоцитов при воздействии ЛПС азоспирилл – непатогенных диазотрофных ризобактерий из группы микроорганизмов, стимулирующих развитие растений.

Были использованы препараты ЛПС Azospirillum lipoferum Sp59b (ЛПСSp59b), A.irakense KBC1 (ЛПСKBC1), A.brasilense Sp245 (ЛПСSp245) и A.brasilense Sр245.5 (ЛПСSр245.5), для сравнения коммерческие продигиозан и ЛПС E.coli 055:В5 в концентрациях 0.01, 0.1 и 1 мкг/мл. Спленоциты выделяли из селезенки беспородных белых мышей весом 18-21 г стандартным методом. Пролиферацию спленоцитов оценивали в реакции бласттрансформации, основанной на включении меченного тритием тимидина в ДНК.

Установлено, что все исследуемые ЛПС оказывали митогенное действие в диапазоне концентраций 0.01-1 мкг/мл. Минимальный пролиферативный ответ получен при действии ЛПСSр245.5, ЛПСSp59b и ЛПСKBC1, которые усиливали синтез ДНК в 1,8–4 раза по сравнению с контролем, однако стимулирующее действие этих препаратов было значительно ниже по сравнению с действием классического митогена – ЛПС E.coli 055:В5.

Показано, что ЛПСSp245 в дозе 1 мкг/мл оказывал пролиферативное действие на уровне эффекта ЛПС E.coli 055:В5 в аналогичной концентрации. Кроме того, десятикратное увеличение концентрации ЛПСSp245 приводило к увеличению пролиферации спленоцитов примерно в 2 раза. Таким образом, митогенную активность в отношении мышиных спленоцитов показали все исследуемые ЛПС азоспирилл. Высокой активностью обладал ЛПСSp245, который наиболее перспективен для дальнейшего изучения иммунотропного действия.

Работа выполнена при частичной поддержке гранта РФФИ 08-04а.

Научные руководители – д-р биол. наук, проф. С.А. Коннова, д-р биол.

наук, проф. Е.И Тихомирова.

ТРИТЕРПЕНОВЫЕ КИСЛОТЫ ВЕГЕТАТИВНЫХ И ГЕНЕРАТИВНЫХ ОРГАНОВ CHAMAENERION ANGUSTIFOLIUM.

–  –  –

Липофильные экстракты генеративных и вегетативных органов иванчая Chamaenerion angustifolium исследованы на содержание урсоловой и олеаноловой кислот. Выбор объектов исследования обусловлен тем, что в условиях сибирской климатической зоны это растение накапливает значительную биомассу, поэтому может служить источником этих биологически активных соединений. В работе применены оригинальные методики экстракции и анализа, обусловливающие исчерпывающее извлечение и высокую точность определения вышеуказанных веществ.

Наиболее распространенные тритерпеновые кислоты урсанового и олеананового ряда – урсоловая и олеаноловая. Они обладают выраженной биологической активностью в разнообразных медико-биологических тестах, в том числе анти-ВИЧ и противораковой.

Для исследования было взято сырье, собранное в Новосибирской области в июне и сентябре 2008 г. Свежесобранное сырье было фракционировано вручную на листья, стебли и цветочные побеги с цветками, а затем высушено раздельно. Измельченное на шнековой дробилке воздушносухое сырье экстрагировали МТБЭ. Для анализа МТБЭ-экстракты обрабатывали водно-спиртовым раствором щелочи для выделения фракции свободных кислот, которую после дериватизации анализировали методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе «Милихром». Наибольшим содержанием тритерпеновых кислот характеризуются экстракты листьев, наименьшим – генеративных побегов с цветками. При этом в процессе вегетации происходит накопление тритерпеновых кислот как в листьях, так и в стеблях. Верификация полученных результатов проведена при помощи ХМС-анализа в ЛФМИ НИОХ СО РАН.

Количественные данные по содержанию целевых кислот практически совпали. В ходе ХМС-анализа выявлено присутствие в экстрактах предельных алифатических кислот с длиной цепи от 10 до 30 углеродных атомов, непредальных линолевой и линоленовой, ароматических кислот, а также тритерпеновой кислоты урсанового ряда – помоловой, обладающей широким спектром физиологической активности. Присутствие в исследуемых экстрактах алифатических кислот с длиной цепи от 24 до 30 углеродных атомов, а также помоловой кислоты выявлено в исследуемом сырье впервые.

Научный руководитель - канд. хим. наук, доцент Т. П. Кукина.

ИЗУЧЕНИЕ УСЛОВИЙ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ НЕКОТОРЫХ ГИДРОЛАЗ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ДРОЖЖЕВЫХ И ГРИБНЫХ

ПРОДУЦЕНТОВ

–  –  –

Инулиназа (КФ 3.2.1.7) может применяться для промышленного получения фруктозы из фруктозосодержащих полимеров. Липаза (КФ 3.1.1.3) входит в состав ряда лекарственных препаратов и чистящих средств. Целью нашей работы было получение гомогенных препаратов инулиназы и липазы из различных микроорганизмов-продуцентов. Чистые культуры Aspergillus awamori BKMF-2250, Kluyveromyces marxianus Y-303 Saccharomyces cerevisiae ВГШ-2 и Rhizopus japonicus 1403 были получены из ВКПМ, Москва. Содержание белка определяли методом Лоури, каталитическую активность энзимов измеряли спектрофотометрическими методами. Гомогенность полученных препаратов контролировали электрофорезом в полиакриламидном геле.

Путем 4-стадиной очистки, включающей осаждение ацетоном, фракционированияе сульфатом аммония, гель-фильтрацию на сефадексе G-25 и ионообменную хроматографию на колонке с ДЭАЭ–целлюлозой, нами был получен препарат инулиназы из A. awamori с 85-кратной степенью чистоты и 5 % выходом. Для выделения энзима из K. marxianus использовали осаждение изопропанолом с последующей гель-хроматографией на сефадексе G-150. Данный подход давал 17,9-кратную степень очистки и 2 % выход. Сочетание нескольких стадий: осаждение изопропиловым спиртом, гель-фильтрация на сефадексах G-25 и хроматография на G-100, позволили предложить эффективный способ очистки инулиназы из экстракта поверхностной культуры S. cerevisiae. По разработанной схеме был получен ферментный препарат с 60-кратной степенью очистки и 7,8 % выходом. Путем 4-стадийной очистки, включающей ультрафильтрацию на мембране УАМ–30, осаждение ацетоном, гель-фильтрацию на G-150 и хроматографию на ДЭАЭ–52 были получены гомогенные препараты двух изоформ липазы из R. japonicus 1403. При этом достигнута 74,7-кратная очистка фракции I и 58-кратная очистка фракции II, с выходом по активности 8,38 и 14,15 % соответственно. Таким образом, нами разработаны эффективные схемы очистки инулиназы из A. awamori, K. marxianus, S.

cerevisiae и липазы из R. japonicus которые обеспечивают достаточно высокий количественный выход и гомогенность фермента.

Научный руководитель - д-р биол. наук, проф. Т. А. Ковалева.

РЕКОМБИНАНТНЫЕ БЕЛКИ, НЕСУЩИЕ ИМИТАТОРЫ ЭПИТОПОВ ВИЧ-1

–  –  –

В качестве одного из кандидатов в вакцину против ВИЧ-1 в ГНЦ ВБ "Вектор" в 90-х гг. был создан искусственный полиэпитопный белок TBI (T and B cell epitоpes containing immunogen), который содержит 4 Тклеточных и 5 В-клеточных нейтрализующих эпитопа из белков ВИЧ-1 Env и Gag. Иммунизации таким белком мышей и обезьян вызывают развитие ВИЧ-специфического иммунного ответа.

В настоящее время появилось много новой информации о вируснейтрализующих эпитопах ВИЧ-1. Получен ряд моноклональных антител к ВИЧ-1, в частности МКА 2F5 и МКА 2G12, обладающих широкой вируснейтрализующей активностью против различных субтипов вируса. Было решено улучшить полиэпитопный белок TBI, используя имитаторы линейных и конформационных антигенных детерминант ВИЧ-1, полученных с использованием техники фагового дисплея.

Цель исследования. Разработать улучшенный вариант белка TBI путем включения в его состав новых пептидов-имитаторов линейных и конформационных эпитопов ВИЧ-1.

Ранее были получены пептиды, имитирующие линейный эпитоп ВИЧузнающиеся МКА 2F5, а также пептиды-имитаторы конформационного эпитопа, узнаваемого МКА 2G12. Для включения в структуру TBI было отобрано по два наиболее активных в иммунологическом плане пептида.

Был проведен синтез олигонуклеотидов, кодирующих отобранные пептиды-имитаторы, и их клонирование в составе гена TBI. В результате были получены рекомбинантные белки TBI-2 и TBI-3, содержащие в своей структуре пептиды-имитаторы, узнаваемые МКА 2F5 и 2G12 соответственно.

Для подтверждения антигенности рекомбинантные белки TBI-2 и TBI-3 были охарактеризованы с помощью иммуноблотинга и ИФА с МКА к ВИЧ-1. Результаты показали, что полученные белки сохранили антигенные свойства встроенных пептидов-имитаторов.

Т.о., были получены рекомбинантные белки TBI-2 и TBI-3, сохраняющие структуры полиэптопного белка TBI и антигенность пептидовимитаторов, входящих в их состав. В дальнейшем предполагается изучение иммуногенных свойств полученных белков.

Научный руководитель – д-р биол. наук, проф. А. А. Ильичев

–  –  –

Рибосома – уникальная рибонуклеопротеиновая машина, являющаяся основным участником одного из ключевых процессов жизнедеятельности клетки – синтеза белка. Молекулярные структуры рибосом бактерий, архей и эукариот существенно отличаются друг от друга. На сегодняшний день структуры обеих субчастиц рибосомы бактерий и большой субчастицы рибосомы архей подробно изучены с помощью рентгеноструктурного анализа (РСА). Рибосомы эукариот устроены гораздо сложнее, чем рибосомы прокариот, и, возможно, поэтому их кристаллы, пригодные для РСА, до сих пор не получены. Это является существенным препятствием к пониманию механизма трансляции в эукариотах и природы многих болезней, связанных с нарушением аппарата биосинтеза белка. Кроме того, информация о структуре эукариотической рибосомы может оказаться важной для создания нового поколения антибиотиков, направленных на подавление трансляции патогенов.

Одним из подходов к изучению структурно-функциональных свойств крупных РНК-белковых комплексов является моделирование их отдельных районов с использованием рекомбинантных белков и соответствующих РНК-транскриптов с последующим анализом образующихся комплексов различными физико-химическими и молекулярно-биологическими методами. Для изучения особенностей взаимодействия рибосомных белков L18e и L30e человека с 28S рРНК нами были созданы суперпродуценты этих белков, осуществлена наработка рекомбинантных белков в клетках E.coli и последующая их очистка с помощью аффинной хроматографии. Используя литературные данные о расположении в большой субчастице рибосом Haloarcula marismortui и Triticum aestivum белков, гомологичных белкам L18e и L30e человека, были предсказаны участки связывания рибосомных белков человека на 28S рРНК. Сконструированы ДНКматрицы для синтеза с помощью Т7-транскрипции фрагментов 28S рРНК, содержащих предполагаемые сайты связывания указанных белков, и синтезированы соответствующие РНК-транскрипты. Найдены оптимальные условия для связывания этих РНК с рекомбинантными белками L18e и L30e и определены кажущиеся константы связывания.

Научный руководитель – канд. хим. наук А. А. Малыгин.

ЦИТОЛОГИЯ И ГЕНЕТИКА

ГЕНОТИПИРОВАНИЕ HELICOBACTER PYLORI ИЗ БИОПСИЙНОГО

МАТЕРИАЛА ПО ГЕНАМ ВИРУЛЕНТНОСТИ СAGA, VACA И ICEA

–  –  –

Helicobacter pylori является грамотрицательным бактериальным патогеном, обитающим в желудке человека, нелечение которой переходит в постоянную, пожизненную инфекцию. Инфицирование H. pylori приводит к таким заболеваниям, как язва желудка и двенадцатиперстной кишки, аденокарцинома дистальной области желудка и лимфома слизистой оболочки. Целью данного исследования является определение распространенности различных генотипов H. pylori на территории Узбекистана по генам вирулентности CagA, VacA и IceA. Для генотипирования нами было взято 60 образцов биопсий из Ташкентской и Хорезмской областей. ДНК бактерии подвергалось генотипированию путем ПЦР-амплификации.

Результаты генотипирования 24 образцов Ташкентского региона показали, что 18 (75%) из них были CagA-положительны. Во всех образцах было обнаружено присутствие гена VacA, однако распределение по подтипам показало следующее: s1/m1 вариант встречался у 3 (12,5 %) пациентов, s2/m2 у 5 (20,8 %) больных, а генотип s1/ m2 - у 9 (37,5 %). Генотипы штаммов H. pylori s1/m1 и s1/m2 VacA имеют максимальный или средний уровень секреции цитотоксина. Генотип штаммов H. pylori s2/m2 проявляет незначительную токсическую активность. Между CagA- и VacAs1-генотипами штаммов H. pylori существует строгая ассоциация большинство VacAs1-штаммов являются CagA-позитивными.

Нами был зарегистрирован большая доля смешанных генотипов VacA (s1/s2 или m1/m2), а так как геном H. pylori содержит только одну копию гена vacA, регистрация смешанных генотипов свидетельствует о присутствии более чем одного штамма в клиническом образце. Такие смешанные генотипы были верифицированы в биопсийном материале в 7 (29,2 %) случаях. Комбинация генов CagA, VacA s1,m1, IceA2 не была обнаружена ни в одном из клинических образцов из Ташкента и Ташкентской области, генотип VacA s1, CagA, IceA1 был выявлен в 7 случаях (29,2 %). Нам удалось выявить отдельный IceA1-генотип в 16 (66,7 %) образцах биопсий. IceA2-генотип выявлен в 11 (45,8 %) образцах биопсий, сочетание IceA1 с IceA2генотипом выявлено в 8 (33,3 %) образцах и лишь в 5 (20,8 %) случаях генотип IceA полностью отсутствовал.

В Хорезмском регионе 28 (77,8 %) образцов оказались CagAположительными. Распределение по подтипам гена VacA показало следующее: s1/m1 вариант встречался в 11 (30,6 %)образцах; s2/m2 ни в одном случае зарегистрирован не был, так как s2 аллель полностью отсутствует в данных образцах биопсий, а генотип s1/ m2 - у 12 (33,3 %). Отдельный IceA1-генотип в 4 (11,1 %) образцах биопсий. IceA2-генотип выявлен в 1 (2,8 %) образце биопсии, сочетание IceA1 с IceA2-генотипом выявлено в 28 (77, 8%) образцах. В 3 (8,3 %) случаях генотип IceA отсутствовал. Образцы из Хорезмского региона отбирались в онкологической больнице, и в большинстве пациенты имели диагноз – рак желудка, то можно сказать, что генотип CagA+, VacA s1,m1, IceА1/A2 является ассоциированным с раковыми состояниями, так как он встречался у большинства пациентов с этим диагнозом.

Данная работа приближает нас к пониманию корреляции генотипов H. pylori с заболеваниями различной этиологии на территории Узбекистана, и открывает перспективу проведения генотип-ассоциированной диагностики.

Научный руководитель – канд. биол. наук, доц. Ш. У. Турдикулова

ОЦЕНКА ИНФИЦИРОВАННОСТИ WOLBACHIA СБОРОВ ИЗ

ПРИРОДНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ DROSOPHILA MELANOGASTER 2008 ГОДА

–  –  –

Wolbachia представляет собой симбиотическую бактерию, широко распространенную среди членистоногих и некоторых нематод. Инфицирование происходит через материнскую цитоплазму. Wolbachia способна вызывать у вида-хозяина репродуктивные аномалии: например, у некоторых перепончатокрылых наблюдается партеногенез и цитоплазматическая несовместимость, у чешуекрылых известны факты феминизации самцов, у жесткокрылых и двукрылых - гибель самцов и цитоплазматическая несовместимость. Все это направлено на то, чтобы увеличить долю инфицированной цитоплазмы в популяции.

Целью нашего исследования была оценка инфицированности природных популяций Drosophila melanogaster эндосимбионтом Wolbachia в сборах 2008 г., а также определение генотипического разнообразия бактерии.

Работа проводилась в рамках мониторинга генетического разнообразия природных популяций дрозофилид. В 2008 г. были изучены выборки D.

melanogaster из популяций Сибири - г. Новосибирск (57 линий), г. Бийск (29), посёлки Черга (39) и Иогач (6); Средней Азии - г. Ташкент (16); Украины - г. Умань (16). Всего исследовано 163 изосамочьих линии. Из каждой изосамочьей линии отбиралось 2-4 самки, гомогенизировались в 200 мкл экстрагирующего буфера (10 mM TRIS-HCl(pH 8.0), 25 mM EDTA, 0,5% SDS, 0,1 M NaCl, 0,1 mg/ml протеиназа K) и инкубировались при 57°С в течение двух часов. Далее ДНК переосаждали по стандартной методике и растворяли в 50мкл. бидистиллированой воды. Присутствие эндосимбионта устанавливали амплификацией генов Wolbachia - wsp, а также 16S рРНК. Полученные ампликоны визуализировали в 1 % агарозном геле. В случае инфицированности линии, устанавливали генотип бактерии по пяти полиморфным маркерам, а именно: присутствие в двух локусах инсерции профага IS5, кратность повтора двух микросателлитных мотивов и наличие инверсии протяженного участка генома Wolbachia. Эндосимбионт был обнаружен во всех популяциях, в выборке Новосибирска уровень инфицированности составил 66,7 %, Бийска - 72%, Черги – 35 %, Иогача – 83 %, Ташкента – 87,5 % и Умани – 75 %.

Из описанных в литературе пяти генотипов Wolbachia было выявлено 2 генотипа. Во всех популяциях был обнаружен генотип wMel, а в Черге и Ташкенте мы обнаружили носителей генотипа wMelCS. Отметим, что ранее в популяциях этих регионов неоднократно обнаруживали генотипы wMelCS и wMelCS2. Известно, что в популяциях Drosophila melanogaster цитоплазматическая несовместимость, индуцируемая Wolbachia, либо не проявляется, либо проявляется на очень низком уровне. Однако в популяциях D. melanogaster бактерия распространена достаточно широко и уровень инфицированности также достаточно высок. Остается неясным, какой фактор определяет столь широкую распространенность бактерии для этого вида.

Научный руководитель – канд. биол. наук Ю. Ю. Илинский

СТАТУС ЭКСПРЕСИИ ГЕНОВ Х-ХРОМОСОМЫ У ОБЫКНОВЕННЫХ ПОЛЕВОК РОДА MICROTUS

–  –  –

На неактивной Х-хромосоме самок млекопитающих обнаружен целый ряд локусов, избегающих инактивации. Их изучение предоставляет уникальную возможность для понимания процесса инактивации и механизмов, предохраняющих гены от транскрипционного сайленсинга. Транскрипционный профиль неактивной Х-хромосомы изучен только у человека. Показано, что 15-25% Х-сцепленных генов избегают инактивации, часть из них формирует на Х-хромосоме человека кластеры, другие представлены отдельными локусами, избегающими инактивации. Однако почти ничего не известно об экспрессии генов на неактивной Х-хромосоме у других видов млекопитающих, а также о различиях в транскрипционных профилях Ххромосомы при импринтированной и случайной инактивации, которые наблюдаются в экстраэмбриональных клетках и клетках взрослых особей соответственно.

В данной работе был установлен статус экспрессии генов Х-хромосомы у обыкновенных полевок рода Microtus. Для 10 Х-сцепленных генов (Ddx3x, Mid, Nap1l3, Rab9, Rbbp7, Sb1.8, Sybl1, Xist, Ube1x и Utx) были найдены отличия нуклеотидных последовательностей ДНК у двух видов полевок рода Microtus – M. arvalis и M. rossiaemeridionalis, – и установлен статус их экспрессии в фибробластах и экстраэмбриональных клетках гибридных самок, полученных от скрещивания и M. arvalis M. rossiaemeridionalis. В фибробластах ген Xist транскрибируется исключительно с неактивной Х-хромосомы; ген Utx стабильно экспрессируется на обеих Х-хромосомах, и следовательно, избегает инактивации; а гены Ddx3x, Rab9 и Sb1.8 демонстрируют гетерогенную экспрессию, инактивируясь в одних линиях фибробластов и избегая инактивации в других. Остальные гены подвергаются инактивации и экспрессируются только с активной Х-хромосомы. В экстраэмбриональных клетках некоторые из инактивирующихся в фибробластах генов экспрессируются с неактивной Ххромосомы, что позволяет предположить менее полную и/или менее стабильную инактивацию в данном типе клеток.

Научный руководитель – канд. биол. наук А.И. Шевченко

МОДИФИКАЦИИ ХРОМАТИНА НЕАКТИВНОЙ ХХРОМОСОМЫ В ПРОЦЕССЕ МЕЙОТИЧЕСКОЙ И ИМПРИНТИРОВАННОЙ ИНАКТИВАЦИИ У ОБЫКНОВЕННЫХ ПОЛЕВОК

–  –  –

У млекопитающих существует три формы инактивации Х-хромосомы:

мейотическая, импринтированная и случайная. Мейотическая инактивация происходит в сперматогенезе у самцов на стадии пахитены в мейозе, когда обе половые хромосомы становятся транскрипционно неактивными. На предымплантационных стадиях развития у самок имеет место импринтированная инактивация, когда инактивации подвергается Х-хромосома, унаследованная от отца. Было высказано предположение, что импринтированная инактивация является следствием мейотической инактивации.

Т.е., в результате мейотической инактивации Х-хромосома сохраняет маркеры неактивного хроматина в зиготе и поэтому предетерминирована в отношении инактивации.

В данной работе мы сравнили паттерн распределения модификаций гистонов на неактивной Х-хромосоме у полевки Microtus rossiaemeridionalis в составе полового тельца и в трофобластных стволовых клетках, где имеет место импринтированная инактивация. Было показано, что в мейотической и в импринтированной инактивации наблюдается сходный паттерн распределения целого ряда модификаций гистонов неактивного хроматина (убиквитинированного гистона Н2А, триметилированного гистона Н3 по лизину К9 и ассоциацией с гетерохроматиновом белком НР1 и НP1). Эти данные подтверждают гипотезу о том, что при импринтированной инактивации Х-хромосома, унаследованная от отца, имеет преинактивированное состояние, которое устанавливается в результате мейотической инактивации.

Научный руководитель – канд. биол. наук А.И. Шевченко

ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОГЕННОСТИ И ПЕРСИСТЕНЦИИ ПОЛИЭПИТОПНОЙ ДНК-ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ВИЧ-1 В ОРГАНИЗМЕ

ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ

–  –  –

В ГНЦ ВБ “Вектор” была разработана кандидатная анти-ВИЧ вакцина КомбиВИЧвак на основе двух искусственных полиэпитоных ВИЧ-1 иммуногенов – TBI (рекомбинантный белок) и TCI (ДНК-вакцина). Вакцина представляет собой мицеллоподобную частицу, центральная часть которой содержит ДНК-вакцину, кодирующую ген TCI (pcDNA-TCI), а на поверхности находится белок TBI. Целью данной работы было изучение клеточного ответа, индуцируемого pcDNA-TCI в составе КомбиВИЧвак, а также проведение исследования персистенции ДНК-вакцины pcDNA-TCI в организме лабораторных животных.

Вакцину КомбиВИЧвак вводили в/м двукратно мышам линии BALB/c (однократная доза 75 мкг плазмиды pcDNA-TCI на мышь). С помощью теста ИФНгамма ELISpot было показало, что ДНК-вакцина pcDNA-TCI в составе КомбиВИЧвак индуцирует образование цитотоксических лимфоцитов, специфичных к эпитопам беков ВИЧ-1 (р24 и gp41).

Для определения длительности персистенции ДНК-вакцины в организме животных был использован метод выделения геномной ДНК из органов иммунизированных животных, а также предложен протокол ПЦР в реальном времени. Чувствительность метода в представленных экспериментах составила 200 копий плазмидной ДНК на 1 мкг геномной ДНК мыши. Было показано, что после внутримышечного введения ДНК-вакцины ее можно обнаружить с помощью real-time ПЦР в коже, легких, селезенке, печени, а также в месте инъекции в мышцах. Введенная плазмидная ДНК pcDNATCI сохраняется в разных органах и тканях неодинаково, однако при этом во всех органов наблюдается уменьшение количества плазмиды с течением времени.

Научный руководитель – д-р биол. наук Л. И. Карпенко

ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ПРОМОТОРА ГЕНА ОРНИТИНАМИНОТРАНСФЕРАЗЫ

ARABIDOPSIS THALIANA

–  –  –

Считалось, что основная функция фермента орнитинаминотрансферазы (ОАТ), локализованного в митохондриях, заключается в синтезе пролина из орнитина. Также существует гипотеза о том, что ОАТ может участвовать в контроле метаболизма азота. Ранее в лаборатории генной инженерии ИЦГ СО РАН было показано, что трансгенные растения табака, экспрессирующие ген ОАТ люцерны, характеризуются повышенной устойчивостью к солевому стрессу, но по содержанию пролина не отличаются от контроля.

Для исследования роли гена ОАТ в регуляции стрессоустойчивости нами было запланировано исследовать особенности его транскрипционного контроля. Целью данной работы является изучение структурнофункциональной организации промотора гена ОАТ Arabidopsis thaliana.

Для этого нами было сделано следующее: (1) Клонирован участок геномной ДНК, прилежащий к белок-кодирующему району гена ОАТ. (2) С помощью методов компьютерного анализа этого участка ДНК выявлены потенциальные сайты связывания транскрипционных факторов. Обнаружено, что эти сайты могут быть вовлечены в контроль экспрессии в условиях засухи, засоления, экстремальных температур, а также при воздействии некоторых фитогормонов. (3) Для проверки этих предсказаний запланировано создание набора из трех конструкций – делеционных вариантов промоторного района, под контролем которых расположен репортерный ген бетаглюкуронидазы E. coli. Сделаны две генетические конструкции на основе бинарного вектора pBI, содержащие участки промотора ОАТ, контролирующие ген-репортер (первый: от -1731 до +100, второй от -1190 до +100).

Работа поддержана грантом Министерства образования и науки ЗН-324-09.

Научный руководитель - канд. биол. наук, доц. А. В. Кочетов.

РАННЯЯ ИНВОЛЮЦИЯ ТИМУСА КАК ВОЗМОЖНАЯ ПРИЧИНА ПРЕЖДЕВРЕМЕННОГО СТАРЕНИЯ КРЫС OXYS

–  –  –

Известно, что развитие комплекса возрастных заболеваний при старении сопровождается нарушениями в работе иммунной системы. Считается, что инволюция тимуса как маркер старения является главным возрастным изменением иммунной системы. В медицинском и социальноэкономическом плане наибольшее значение имеет преждевременное старение. Широкие возможности для изучения этого процесса открывает использование созданной в ИЦиГ СО РАН линии крыс OXYS. Их отличает раннее проявление фенотипических признаков старения и ассоциированных с ним возрастных заболеваний, которые наблюдаются на фоне ранней инволюции тимуса и снижения активности Т-клеточного звена иммунной системы. Причины этих нарушений до сих пор не выяснены.

Целью настоящей работы явилось выяснение природы ранней инволюции тимуса у крыс линии OXYS. Исследования были проведены на 64 животных. Контрольными были крысы линии Вистар. Методом проточной цитофлуориметрии проанализировано количество Т-клеток различных субпопуляций тимуса в критических возрастных периодах. Было показано, что у 10 дневных крыс OXYS увеличено содержание самых ранних, наименее дифференцированных двойных позитивных тимоцитов, что свидетельствует о том, что тимопоэз в этом возрасте находится на достаточно высоком уровне, но процессы дифференцировки уже нарушены. Относительное содержание различных субпопуляций тимоцитов не претерпевает значительных межлинейных и возрастных колебаний, однако абсолютное количество клеток всех субпопуляций тимоцитов значительно снижено у крыс OXYS в возрасте 2 и 3,5 месяца. Исследование апоптоза этим методом не прояснило ситуацию, поэтому на следующем этапе работы методом Western blotа был проведен анализ экспрессии антиапоптотического гена Bcl-2. В возрасте 10 дней и 2 месяца экспрессия этого гена достоверно снижена у крыс OXYS, что свидетельствует о том, что апоптоз возможно является одним из механизмов ранней инволюции тимуса крыс OXYS.

Исходя из полученных результатов, можно сделать вывод о том, что преждевременное старение крыс OXYS возможно связано с дефектами развития тимуса.

–  –  –

Опушение листа имеет большое биологическое значение при адаптации растений к факторам внешней среды, таким как засуха, УФоблучение, некоторые токсины, а также участвует в защите от ряда вредителей. Кроме того, опушение листа участвует в ряде физиологических реакций растения. Трихомы пшеницы представляют собой одноклеточные образования эпидермиса простой конической формы. Длина и плотность трихом значительно варьирует в зависимости от генотипа и условий среды, поэтому опушение листа пшеницы является сложным комплексным признаком. Предполагается, что клетки трихом, основной объём которых вынесен за плоскость эпидермы увеличивают эффективность работы устьичного аппарата. Цель данной работы: провести сравнительный анализ морфологии опушения различных сортов, а также между отдельными генотипами в расщепляющейся популяции, что позволит судить о генетическом контроле данного признака.

В настоящей работе для оценки характеристик опушения листа использован метод, основу которого составляет компьютерный анализ микроизображений поперечного сгиба листа. Этот метод позволяет оценивать широкий спектр параметров опушения. Проведён детальный анализ опушения как сложного, многомерного, признака на примере пары сортов (Голубка и Балаганка), не отличимых по опушению как тактильно, так и визуально. Образцы этих сортов при помощи кластерного анализа были разбиты на группы по сходству характера опушения. С помощью генетического анализа для сортов Саратовская 29 и Голубка показано, что наличие опушения контролируется разным количеством генов. Был проведён кластерный анализ морфологии опушения, подтверждающий генетические различия между сортами. Также в данной работе проведён многомерный кластерный анализ полиморфизма опушения листа гибридов второго поколения китайского сорта Hong-Mang-May и линии сорта Родина с интрогрессией генов контроля опушения от Aegilops speltoides. Сделаны предположения относительно наследования признака.

–  –  –

ИССЛЕДОВАНИЕ ЧАСТОТ ПОЛИМОРФНЫХ ВАРИАНТОВ

1019CG ГЕНА 5-HT1A РЕЦЕПТОРА В ПОПУЛЯЦИЯХ КОРЕННЫХ НАРОДОВ СЕВЕРА СИБИРИ (ХАНТОВ, КОМИ И ТУНДРОВЫХ НЕНЦЕВ)

–  –  –

Медиатор головного мозга серотонин выполняет множество функций в ЦНС млекопитающих. Серотониновые рецепторы 5-HT1A играют ключевую роль в ауторегуляции активности серотониновых нейронов и секреции нейротрансмиттера и, следовательно, вовлечены в регуляцию психических процессов, контролируемых серотонином. Однонуклеотидная замена -1019СG находится в регуляторной области гена 5-HT1A рецептора (HTR1A). Было показано, что данный полиморфизм способен влиять на экспрессию гена HTR1A in vitro. Целью данного исследования было изучение распределения полиморфных вариантов -1019СG гена HTR1A в популяциях коренных народов севера Сибири.

Исследование проводилось в популяциях коренных жителей ЯмалоНенецкого АО, в соответствии с международными правилами информированного согласия. Выборка включала 118 хантов, 122 коми и 105 тундровых ненцев, не связанных родством. Национальная принадлежность определялась на основании генеалогических данных. ДНК из образцов крови выделялась стандартным фенол-хлороформным методом. Генотипирование на полиморфизм -1019СG гена HTR1A проводилось методом аллельспецифичной ПЦР. Частоты аллелей и генотипов в популяциях сравнивались методом хи-квадрат.

Распределение генотипов во всех популяциях не отличается достоверно от равновесного распределения Харди-Вайнберга. Частоты минорного аллеля -1019G гена HTR1A у коми (39 %) и хантов (25 %) в целом близки к частотам, характерным для исследованных ранее европеоидных и монголоидных популяций (30-37% и 20-25% соответсвенно), и при этом достоверно различаются между собой (p0.01). У тундровых ненцев -1019G аллель оказался преобладающим (55 %), его частота отличается достоверно от частот в популяциях хантов (p0.001) и коми (p0.01). Данное исследование открывает путь к изучению функциональной роли полиморфных вариантов гена 5-HT1A рецептора в популяциях коренных народов Сибири.

Научный руководитель – д-р биол. наук, с. н.с. А. В. Куликов

–  –  –

Opicthorchis felineus является возбудителем описторхоза, инвазийного заболевания, широко распространенного среди населения ОбьИртышского бассейна. Применяемые методы диагностики и лечения описторхоза недостаточно эффективны, что делает актуальным его подробное изучение. В Институте цитологии и генетики СО РАН была запущена программа "Геномика, протеомика, биоинформатика", в ходе которой планируется расшифровка генома O. felineus, детальный транскриптомный и протеомный анализ, описание морфологии и изучение всех стадий развития паразита с использованием современного оборудования для биологических исследований.

Целью данной работы является выяснение гистохимических особенностей взрослой особи O. felineus с элементами детализации морфологии.

Проведены окрашивания на различные классы биологических соединений, а также обзорные окрашивания. С помощью известных красителей в организме трематоды выявлены гликозаминогликаны, гликоген, липиды, вещества разного сродства с кислотами и основаниями, а также проведено морфологическое описание, результатом которого стало создание каталога, включившего в себя также изображения, полученные с помощью лазерной сканирующей и электронной микроскопии.

Работа выполнена на оборудовании Carl Zeiss и поддержана грантом Carl Zeiss.

Научный руководитель – д-р биол. наук Н. Б. Рубцов

СПОНТАННЫЕ МУТАЦИИ УСТОЙЧИВОСТИ К

СПЕКТИНОМИЦИНУ ПРИ ПОЛУЧЕНИИ ТРАНСПЛАСТОМНЫХ

РАСТЕНИЙ МОРКОВИ

–  –  –

Создание транспластомных растений основано на переносе и встраивании фрагментов экзогенной ДНК в геномы пластид (пластомы). В состав генетических конструкций для получения транспластомных растений включены гены устойчивости к антибиотикам (спектиномицину, стрептомицину, канамицину), обеспечивающие возможность сортировки и отбора трансформированных клеток. Однако в ходе длительного пребывания клеток растений на селективной среде возможно возникновение спонтанных мутаций устойчивости к антибиотикам. Целью представленной работы является изучение спонтанных мутаций устойчивости к спектиномицину при получении транспластомных растений моркови. Для получения транспластомных растений использовали метод биобаллистики с применением генной пушки BIORAD (США) и генетические конструкции с геном aad, обеспечивающим устойчивость к спектиномицину. Всего было получено 8 независимых линий каллусов моркови, сохраняющих зеленый цвет на среде со спектиномицином (500 мг/л) в течение длительного времени (нескольких месяцев). Встраивание фрагментов экзогенной ДНК в хлоропластный геном проводили методом ПЦР с праймерами на ген aad. В результате ПЦР-анализа образцов ДНК ни в одной из 8 линий не было выявлено продуктов амплификации с праймерами на ген aad, что подтверждало его отсутствие в составе хлоропластного генома каллусных линий моркови, устойчивых к спектиномицину.

Известно, что спонтанные мутации по гену rrs16, кодирующему 16S рРНК, обеспечивают устойчивость растительных тканей к антибиотикам.

В результате анализа нуклеотидного состава в районе гена rrs16 у одной линии выявлена замена нуклеотида G на Т в позиции 1012. На основании рестрикционного анализа установлено, что у 3-х линий также имеется мутация в данном сайте, тогда как в оставшихся 4-х - такой мутации не выявлено.

Научный руководитель – д-р биол. наук Е. В. Дейнеко

ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ ГЕНОФОНДА мтДНК НАСЕЛЕНИЯ ПОЗДНЕКРОТОВСКОЙ КУЛЬТУРЫ БАРАБЫ (ВТОРАЯ ПОЛОВИНА II ТЫСЯЧЕЛЕТИЯ ДО Н.Э.)

–  –  –

Для лесостепного пояса Западной Сибири археологами определена последовательность существования этнокультурных сообществ с периода неолита до позднего средневековья. Анализ особенностей изменения материальной культуры и антропометрических параметров этих групп свидетельствует о возможном влиянии миграционных потоков на состав населения региона в различные периоды времени. Современные методы палеогенетики потенциально позволяют выявлять и характеризовать генетические элементы, проникавшие в регион, с миграционными потоками, устанавливать источники волн миграции и характер их влияния на генофонд аборигенного населения.

Во второй половине II тыс. до н.э., в эпоху развитой бронзы, археологи фиксируют миграцию на территорию Барабы представителей андроновской этнокультурной общности и прослеживают их сосуществование с аборигенным позднекротовским населением. В настоящей работе представлены результаты исследования гаплотипического разнообразия митохондриальной ДНК (мтДНК) в генофонде позднекротовского населения Барабы, а также сопоставления его с генофондами носителей, как предшествовавших автохтонных культур, так и пришлой андроновской культуры из материалов археологических памятников Барабы.

В генофонде позднекротовцев выявлены гаплогруппы как западноевразийского, так и восточноевразийского кластеров мтДНК. Показана высокая степень генетической преемственности позднекротовцев с предшествовавшими группами населения Барабы. С одной стороны, новый компонент мтДНК позднекротовцев, представленный линиями гаплогруппы T, по-видимому, был привнесен андроновцами, так как является общим для генофондов обеих групп. С другой стороны, в генофонде носителей андроновской культуры присутствуют линии мтДНК, характерные для автохтонного населения региона, включая позднекротовское. Таким образом, миграция андроновского населения на территорию Барабы, по-видимому, могла сопровождаться взаимными генетическими контактами по женской линии с аборигенным населением.

ДИНАМИКА КЛЕТОЧНЫХ АССОЦИАЦИЙ В ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ИНФИЛЬТРАТАХ ПРИ СУПЕРИНВАЗИОННОЙ ФОРМЕ

ОПИСТОРХОЗА

–  –  –

Данная форма гельминтоза влияет на активность и потенциал жизни людей гиперэндемичных очагов. У лиц, проживающих на территории Среднего Приобья, описторхоз чаще имеет суперинвазионную форму.

Степень развития клеточных воспалительных инфильтратов в ткани печени отражает тяжесть клинической формы паразитарного процесса и реактивность организма хозяина на внедрение чужеродного антигена, поэтому представляется важным исследовать состав клеточных инфильтратов при суперинвазионной форме гельминтоза в динамике. Суперинвазионный описторхоз моделировали на 20 хомяках-самцах. Развитие процесса прослежено в динамике на 7, 15, 30, 60 сутки инвазии. Определяли качественный состав клеточных воспалительных инфильтратов.

Инвазия 7 суток. В динамике клеточных ассоциаций в перидуктальных инфильтратах доминируют малые лимфоциты (57,3±0,007%). Эозинофилы – составляют 6,2± 0,034%, фибробласты – 5,00± 0,408%. Инвазия 15 суток. В составе инфильтратов: повышается содержание эозинофилов – 15,7±0,03%, увеличивается представительство плазматических клеток – 15,2±0,007%, количество малых лимфоцитов снижается до 34,8±0,007%;

увеличивается количество макрофагов – до 4,9±0,002%. 30 суток инвазии.

В клеточном составе инфильтратов значительно повышается содержание эозинофилов – до 25,2±0,001%. Количество плазматических клеток остаётся практически прежним – 14,9±0,001%,отмечается тенденция к снижению лимфоцитов до 20,6%±0,043%. 60 суток инвазии. Динамика клеточных ассоциаций в перидуктальном воспалительном инфильтрате следующая: сохраняется низкое содержание лимфоцитов 15,1±0,043%, эозинофильных лейкоцитов 8,3±0,001% и увеличивается удельный вес плазматических клеток 36,1±0,001%.

Таким образом, увеличение эозинофильных гранулоцитов с 7-х по 30-е сутки свидетельствует об активации к 30-м суткам инвазии клеточного звена иммунитета антипаразитарной защиты, а преобладание к 60-м суткам плазматических клеток - о напряжении гуморального звена иммунитета.

<

–  –  –

Для получения генетически модифицированных (трансгенных) растений используют рекомбинантные штаммы A. tumefaciens, в которых участок природной Т-ДНК заменен фрагментом экзогенной (целевой) ДНК.

Процесс агробактериальной трансформации растений может быть сопряжен с переносом в растительный геном фрагментов бактериальных ДНК, лежащих за границами Т-области. В связи с этим оценка частоты переноса фрагментов векторных ДНК в хозяйственно-важные растения представляется весьма актуальной.

Исходным материалом служили трансгенные растения моркови Daucus carota сорта «Нантская», полученные в лаборатории биоинженерии растений ИЦиГ СО РАН ранее, при использовании векторов pBi121 и pBinplus/Ars. Для установления частоты встраивания векторных последовательностей в геном трансгенных растений проводили ПЦР с различными типами праймеров. Для предварительного установления наличия в образцах ДНК моркови, а также установления трансгенного статуса, использовали праймеры на ген car экстенсина моркови, и на ген nptII. Для установления частоты встраивания векторных последовательностей использовали серию праймеров на различные участки векторной ДНК. В геномной ДНК 81 независимо полученного методом агробактериального переноса трансгенного растения моркови выявлены фрагменты, соответствующие векторным последовательностям плазмид pBi121. Выявлен широкий спектр взаиморасположения векторных фрагментов в геноме анализируемых трансгенных растений моркови. Установлено, что векторные фрагменты могут быть интегрированы в геном одного и того же трансгенного растения как сцеплено с Т-ДНК, так и независимо от нее.

Научный руководитель - д-р биол. наук Е. В. Дейнеко

ИЗУЧЕНИЕ УЛЬТРАСТРУКТУРЫ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК, ПОЛУЧЕННЫХ СЛИЯНИЕМ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ

КЛЕТОК И ФИБРОБЛАСТОВ МЫШИ

–  –  –

Повышенный интерес к эмбриональным стволовым клеткам (ЭСК) обусловлен их свойством плюрипотентности. Однако механизмы, контролирующие поддержание плюрипотентности и ее утрату в процессе дифференцировки клеток, до сих пор мало изучены. Поэтому актуально исследование процесса репрограммирования генома. Одним из оригинальных подходов является изучение гибридных клеток, полученных слиянием ЭСК и соматических клеток. Целью данной работы было изучение проявления репрограммирования геномов в гибридах, полученных при слиянии ЭСК, эмбриональных диплоидных (ДФМ) и тетраплоидных (ТФМ) фибробластов мыши, на уровне их ультраструктурной организации. Нами был разработан метод приготовления образцов, позволяющий проводить сравнительный ультраструктурный анализ клеток на продольных и поперечных срезах. Исследование клеток выявило существенные различия в ядерно-цитоплазматических отношениях исходных (ЭСК, ДФМ и ТФМ) и гибридных клеток. ТФМ несколько отличаются от ДФМ по размерам клеток, хотя форма клеток, ядер и плотность органелл в цитоплазме у них сходна.

Сравнительный электронно-микроскопический анализ ультраструктуры исходных клеток и их гибридов показал, что ЭСК имеют округлую форму и небольшое количество органелл в цитоплазме, тогда как ДФМ и ТФМ представляют уплощенные клетки с высокой плотностью органелл в цитоплазме и расширенными цистернами эндоплазматического ретикулума (ЭПР). Гибридные клетки, получаемые при слиянии ДФМ с ЭСК, сходны с ЭСК по основным морфологическим параметрам, однако плотность органелл в их цитоплазме сопоставима с ДМФ. Клетки гибридов, полученных при слиянии ТФМ с ЭСК, проявляют морфологию исходных фибробластов, но при этом отличаются значительными инвагинациями ядерной оболочки. Предполагается, что это связано с присутствием в ядре избыточного количества хромосом.

Научный руководитель:– канд. биол. наук, c. н. с. Е. В. Киселева

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПРОМОТОРНОЙ ОБЛАСТИ ГЕНА

XIST МЫШИ (MUS MUSCULUS)

–  –  –

У многих видов живых организмов существуют механизмы дозовой компенсации, необходимость которых вызвана различием в наборах половых хромосом у самок и самцов. Эти механизмы координируют активность сотен генов и стартуют достаточно рано в жизни организма. У высших млекопитающих в процессе дозовой компенсации большинство генов на одной из двух генетически идентичных X-хромосом самок перестает экспрессироваться («замолкает»), и в таком неактивном состоянии остается в течение всего онтогенеза. Процесс инактивации контролируется генетическим локусом – центром инактивации (Xic – X chromosome inactivation center). Xic содержит ряд элементов, ответственных за подсчет, выбор будущей неактивной Х-хромосомы и инициацию инактивации. Ген Xist, расположенный в Xic, является ключевым фактором в инициации инактивации. Он кодирует длинную нетранслируемую РНК, распространяющуюся в процессе инактивации по Х-хромосоме, что приводит к гетерохроматинизации и транскрипционному молчанию расположенных на ней генов.

Целью данной работы является анализ регуляторной области гена Xist мыши. Для этого, исследовали активность репортёрных конструкций, методом временной трансфекции, содержащих ген люциферазы под контролем различных элементов 5’ области гена Xist. Экспрессия репортерных конструкций исследовалась в двух типах клеток самок: в первичной клеточной культуре фибробластов линии MEF и в эмбриональных стволовых клетках линии MES-BL6. В обоих типах наблюдался сходный уровень экспрессии. В результате экспериментов были выявлены районы с различной регуляторной активностью. Одни из них способны значительно усиливать экспрессию, в то время как другие почти полностью подавляют ее.

В этих районах предполагается наличие энхансерных и сайленсерных элементов, соответственно. Всего было обнаружено 6 таких районов, по 3 каждого типа. С помощью компьютерного анализа в данных районах обнаружены потенциальные сайты связывания факторов SRY, ER, RAR и других. На основании полученных данных можно предположить существование различных механизмов регуляции экспрессии гена Xist на разных стадиях онтогенеза и в разных тканях.

Научный руководитель - канд. биол. наук Е. А. Елисафенко

ПРОЦЕСС РЕПЛИКАЦИИ ХРОМАТИНА НА РАЗЛИЧНЫХ

СТАДИЯХ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА В ПОЛИПЛОИДНЫХ ЯДРАХ

НА ПРИМЕРЕ ТРОФОЦИТОВ CALLIPHORA ERYTHROCEPHALA

–  –  –

Изучение закономерностей оогенеза занимает важное место в современных исследованиях биологии развития.

Процесс политенизации хромосом, происходящий в трофоцитах насекомых в ходе оогенеза, характеризуется сложными морфологическими преобразованиями хроматина. Политенизация сопровождается полным и необратимым блокированием митотической активности.

C. еrythrocephala является прекрасным объектом для изучения процессов оогенеза, но в то же время и малоизученным с точки зрения молекулярной биологии.

Для анализа клеточного цикла, как одного из факторов детерменирующих хроматиновую организацию в полиплоидных и диплоидных клетках, нами было проведено изучение репликации хроматина в трофоцитах C.

еrythrocephala на ранних стадиях оогенеза. В работе был использован метод мечения бромдезоксиуридином (BrdU) трофоцитов яичников C.

еrythrocephala.

В результате исследований были получены следующие результаты. Известно, что после того, как фолликул отделяется от гермария, ядра трофоцитов имеют первичную ретикулярную структуру. На этой стадии нами было отмечено включение BrdU, что свидетельствует о репликации хроматина. Трофоциты находятся на S-фазе эндоцикла. После его завершения ядро увеличивается в размерах, что обусловлено накоплением ДНК. В более зрелых ядрах на стадии формирования политенных хромосом так же выявлен процесс эндоредупликации хроматина. Следующая синтетическая фаза была отмечена на стадии компактизации хроматина и образования помпонообразных хромосом. На заключительном этапе морфологических преобразований хроматина – вторичная ретикулярная структура, мы наблюдали активную репликацию хроматина.

Таким образом, было выявлено строгое соответствие фаз эндомитотического цикла и стадий морфологических преобразований хроматина в ядрах трофоцитов яичников C. еrythrocephala.

Научный руководитель – д-р биол. наук, проф. В. Н. Стегний

ДОМЕНЫ, КОНТРОЛИРУЮЩИЕ ЭКСПРЕССИЮ ТРАНСГЕНОВ В ГЕНОМЕ DROSOPHILA MELANOGASTER

–  –  –

Изучение экспрессии с помощью трансгенных конструкций является перспективным направлением в этой области. Особенно эффективно использование трансгенов для исследования влияния на экспрессию окружающего хроматина. Достоверно показано, что активность трансгенных конструкций коррелирует с состоянием окружающего их хроматина [1]. В последнее время появилось множество свидетельств о существовании доменного уровня регуляции экспрессии генов у разных организмов [2]. Для Drosophila melanogaster, как для основного модельного объекта в теоретической генетике, показано существование районов поздней репликации (UR domains) [3]. Эти домены отличаются поздней репликацией в S фазе, в следствии чего, в политенных хромосомах слюнных желез они "недореплицированны". В данный момент ведется активное изучение свойств этих районов [4], что могло бы помочь установить принципы и особенности доменной регуляции экспрессии у дрозофилы и, возможно, других организмов. В данной работе рассматривается специфика экспрессии транспозонов, несущих маркеры mini-white и yellow, в UR-районах и их флангах.

Обнаружено значительное снижение числа и активности трасгенных конструкций в районах поздней репликации, а так же некоторые особенности их встраивания в исследованные области.

______________________________

1. C. Yan, D.D. Boyd, Histone H3 acetylation and H3 K4 methylation define distinct chromatin regions permissive for transgene expression, Mol. Cell Biology (2006).

2. H. J. Gierman et al., Domain-wide regulation of gene expression in the human genome, Genome Research (2007).

3. S. N. Belyakin et al., Genomic analysis of Drosophila chromosome underreplication reveals a link between replication control and transcriptional territories, Proc Natl Acad Sci U S A, 102 (2005).

Научный руководитель – канд. биол. наук В.Н. Бабенко

АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ ГЕНОФОНДА КОРЕННЫХ ХАНТОВ ПО

ДАННЫМ Y-ХРОМОСОМЫ

–  –  –

Охарактеризована структура генофонда хантов, представленных неродственными мужчинами из пос. Русскинские, Сургутского района (N=66) и пос. Казым, Белоярского района (N=46) ХМАО с использованием двух систем генетических маркеров нерекомбинирующей части Yхромосомы – 52 диаллельных и 17 микросателлитных.

В результате в генофонде хантов выявлено пять гаплогрупп: N1b (N2), N1c1 (N3а), Q*, R1a1 и R1b1b2 (R1b3), что свидетельствует о формировании его на базе ограниченного числа генетических компонент. Показана сильная неоднородность исследованных выборок по составу и частотам различных гаплогрупп. В популяционной выборке северных хантов (пос.

Казым) с наибольшей частотой (44%) представлена гаплогруппа Q*, а в генофонде южных хантов (пос. Русскинские) ее частота лишь 5%. При этом в генном пуле южных хантов с частотой 24% представлена гаплогруппа R1a1, не найденная у северных.

Проведен филогенетический анализ линий Y-хромосомы путем составления индивидуальных гаплотипов по YSTR. Анализ распределения гаплотипов свидетельствует о наличии у хантов локального эффекта основателя по гаплогруппам N1b и R1a1. Проведена оценка генетической дифференциации с помощью анализа молекулярной дисперсии (AMOVA) для двух обследованных популяционных групп (Fst составил 20,61%), а также с привлечением двух популяционных выборок по данным литературы.

При делении хантов на три группы в соответствии с географическим местом их проживания уровень Fst максимален (28,41%). Общий уровень генетической дифференциации рассматриваемой системы популяций составил 21,85%. В целом результаты свидетельствует о сильной генетической подразделенности генофонда хантов. Проведена оценка генетического разнообразия на основании частот диаллельных гаплогрупп и микросателлитных гаплотипов. В целом ханты характеризуются низким уровнем генетического разнообразия, по сравнению с другими южносибирскими этносами: у южных хантов H=0.49, у северных H=0.68. Проведена оценка относительного вклада различных предковых групп населения в состав разных субпопуляций.

Работа получила финансовую поддержку РФФИ (06-04-48274, В.С.) и гранта Президента Российской Федерации (МК-3362.2008.4, В.Х.).

Научный руководитель – д-р биол. наук, проф. В.А. Степанов

ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОГЕННЫХ СВОЙСТВ КОМБИНИРОВАННОЙ ПОЛИЭПИТОПНОЙ ДНК/БЕЛКОВОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ

ВИЧ-1

–  –  –

Во ФГУН ГНЦ ВБ “Вектор” была разработана кандидатная анти-ВИЧ вакцина КомбиВИЧвак на основе двух искусственных полиэпитоных ВИЧиммуногенов – TBI (рекомбинантный белок) и TCI (ДНК-вакцина). Вакцина представляет собой мицеллоподобную частицу, центральная часть которой содержит ДНК-вакцину, кодирующую ген TCI (pcDNA-TCI), а на поверхности находится белок TBI.

Целью данной работы было изучение параметров иммунного ответа, вызываемого КомбиВИЧвак.

Вакцину КомбиВИЧвак вводили в/м, в/б и п/к двукратно мышам линии BALB/c (однократная доза вакцины содержит 75 мкг плазмиды pcDNA-TCI и 50 мкг белка TBI на мышь). В результате проведенных исследований было показано, что при в/м введении КомбиВИЧвак формируется гуморальный ответ на белки ВИЧ-1 (лизат ВИЧ-1, gag, рекомбинантные белки тестсистемы), а также образование Т-клеток памяти, секретирующих ИЛ-2, ИЛИЛ-10, ИФНГамма ответ на стимуляцию антигенами ВИЧ-1. Сыворотка иммунизированных животных обладала вируснейтрализующей активностью при инфицировании клеток МТ-4. Иммунный ответ, индуцируемый КомбиВИЧвак, имел характер Th2-ответа.

Кроме того, было показано, что компонент КомбиВИЧвак, ДНКвакцина pcDNA-TCI, оказывает влияние на гуморальный ответ, вызываемый белком TBI. Так, наблюдалось синергичное усиление ответа, а также увеличение степени отклонения в сторону Th2-ответа.

Научный руководитель – д-р биол. наук Л. И. Карпенко

ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ТАБАКА С ГЕНАМИ БЕЛКОВ ОБОЛОЧКИ ВИРУСА ГЕПАТИТА В

–  –  –

Современная вакцинация против вируса гепатита В основана на применении рекомбинантного поверхностного антигена HbsAg с использованием для его экспрессии дрожжей (Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris), такая вакцина не лишена недостатков и требует дальнейшего ее улучшения. Трансгенные растения, в тканях которых накапливаются антигены против различных возбудителей болезней, могут быть использованы в качестве «съедобных вакцин», в том числе и против вируса гепатита В.

HbsAg-антиген в составе оболочки вирусной частицы гепатита В представлен в виде трех белков: S (короткого), M (cреднего) и L (большого).

Все три формы HbsAg-антигена используются в настоящее время в разработках по созданию «съедобных» вакцин с использованием различных видов растений – картофель, томаты, морковь и др.

Цель работы – оптимизация уровня накопления HbsAg-антигена в тканях листовых пластинок двух групп трансгенных растений табака, используемых в качестве модели для оценки накопления исследуемого антигена.

В одной из групп HbsAg-антиген представлен в виде белка, слитого с сигналом транспорта в люмены эндоплазматического ретикулума, а в другой

– антиген не содержит таких сигналов.

Для получения трансгенных растений табака использовали два типа генетических конструкций, содержащих кодирующие последовательности HbsAg-антигена (S-форма) под контролем 35S-промотора вируса мозаики цветной капусты, встроенные в бинарный вектор pBINPLUS/ARS (конструкции были любезно предоставлены к.б.н. Е.А.Уваровой и д.б.н., проф. С.Н.Щелкуновым).

Трансформацию растений табака (Nicotiana tabacum L.) проводили методом агробактериального переноса с использованием метода листовых дисков на линии SR1. Наличие перенесенных генов подтверждали методом ПЦР c тремя типами праймеров. Наличие HBsAg-антигена в тканях трансгенных растений табака определяли методом ИФА, используя набор Вектогеп В D-0556 (Вектор-Бест, Россия).

К настоящему времени генетические конструкции перенесены в растения табака, наличие целевого гена в геномной ДНК подтверждено ПЦРанализом, проводится сравнительный анализ уровня накопления HbsAgантигена в двух исследуемых группах трансгенных растений.

Научный руководитель - д-р биол. наук Е. В. Дейнеко

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ИНТЕНСИВНОСТИ СВЕТА НА РОСТ

ЛИСТОВЫХ МУТАНТОВ ГОРОХА PISUM SATIVUM L. СОРТОВ

СМАРАГД И НОРД

–  –  –

Мутанты гороха с измененным морфотипом листа в настоящее время получают широкое распространение. Форма листа у гороха определяется несколькими локусами, прежде всего генами Af, Tl, St. Ген Af локализован в первой, ген Tl – в пятой, а ген St – в третьей хромосоме гороха Pisum sativum L.

В норме генотип Af/Af листа гороха, наряду с парой развитых прилистников имеет несколько пар листочков, в верхней части листа – умеренно развитые усики. У генотипа AfAfTlTlstst редуцированы прилистники. Генотип AfAftltlStSt характеризуется отсутствием усиков (акациевидный лист), а генотип afafTlTlStSt полным отсутствием листочков. В этом случае плейотропное влияние рецессивного гена af проявляется в формировании сильно развитых и многократно разветвленных усиков. Благодаря чему такие безлисточковые формы приобретают признак устойчивости к полеганию. Этим и определяется интерес генетиков как к исходному для селекции материалу.

Вместе с тем недостаточно изученными остаются физиология подобных форм, характер их роста, продуктивность фотосинтеза, чувствительность к интенсивности ФАР (фотосинтетическая активность радиации) и т.д. В связи с этим представляло интерес провести сравнительное исследование влияние интенсивности света на рост листовых мутантов гороха, характеризующихся нормальным и безлисточковым (усатым) типом листа.

Изучена реакция афильных и нормальных форм гороха на изменение интенсивности света. Площадь проекции растений у афильных сортов по сравнению с нормальным уменьшена в несколько раз. Повышение уровня облученности незначительно влияет на этот показатель. Реакция удлинения стебля и усиков светозависима: их длина уменьшается при возрастании интенсивности света. При этом меняется и суммарная площадь листочков и прилистников. Наибольшим изменениям подвергается площадь листочков. Обсуждаются возможные пути регуляции фотосинтетически активной радиацией ростовых процессов у нормальных и афильных геноформ у гороха.

Научный руководитель – канд. биол. наук А. С. Ооржак

ОСОБЕННОСТИ ЦИТОМИКСИСА В МАТЕРИНСКИХ КЛЕТКАХ ПЫЛЬЦЫ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

–  –  –

Цитомиксис – это перемещение клеточного содержимого (цитоплазмы, органелл и ядра) из одной клетки в другую по цитомиктическим каналам.

Это явление встречается у многих видов растений, чаще всего, в материнских клетках пыльцы (МКП). Так как в результате цитомиксиса в отдельных МКП может возникнуть избыток (или недостаток) хроматина, то вполне ожидать появление среди таких растений отдельных форм с измененным числом хромосом (поли- и анеуплоиды). В литературе обсуждается связь цитомиксиса с наличием В-хромосом.

Трансгенные растения табака линии Res79 (4n=96), проявляющие высокий уровень цитомиксиса в МКП, послужили в качестве модельного объекта. Образцы Dactylis glomerata L. были использованы для изучения цитомиксиса в природных популяциях. На линии Res 79 исследования проводили на световом и ультраструктурном уровне (в качестве контроля использовали линию табака SR1). Установлено, что хроматиновый материал перемещался между МКП по цитомиктическим каналам без какихлибо видимых структурных нарушений. Показано, что цитомиктические каналы могут образовываться двумя путями: при разрушении плазмодесм и de novo с помощью специфических электронноплотных тел.

В образцах Dactylis glomerata L. на световом уровне выявлены особенности цитомиксиса в МКП и проведено сравнение частот этого явления между образцами из периферийных и центральных областей ареала произрастания этого вида. Установлено, что уровень цитомиксиса достоверно выше в образцах D. glomerata из периферийных популяций. Выявлены достоверные отличия по частоте цитомиксиса между образцами внутри групп «центр/периферия».

Научный руководитель – д-р биол. наук Е.В. Дейнеко

ОЦЕНКА IN VIVO ПЛЮРИПОТЕНТНОСТИ ГИБРИДНЫХ

ES-КЛЕТОК РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ И ПЛОИДНОСТИ

–  –  –

Клеточные гибриды, представляющие собой сочетание двух геномов с разным плюрипотентным статусом, позволяют изучать явление репрограммирования. Используя тест на химеризм можно проанализировать вклад таких клеток в формирование целостного организма. Целью настоящей работы является исследование колонизации in vivo различных тканей химер гибридными ES-клетками различного происхождения и плоидности.

Для её достижения было необходимо: проанализировать жизнеспособность химер; определить типы тканей, которые преимущественно заселяются потомками введённых гибридных ES-клеток четырёх линий (TauGFP, Tef, Taf и D3T14); предложить модель колонизации тканей гибридными ES-клетками.

Линия Tau-GFP является исходной и представляет собой диплоидные ES-клетки, меченные GFP. Гибридные линии Taf и Tef имеют околотетраплоидный кариотип, получены слиянием Tau-GFP и фибробластов взрослой мыши или эмбриона, соответственно. Клетки линии D3T14 имеют тетраплоидный кариотип и представляют собой гибрид ES-клеток линий TauGFP и D3.

Химеры Taf, Tef и D3T14 имеют клеточный состав 2n/4n, а химеры Tau-GFP – 2n/2n и используются в качестве контроля. Гистологический анализ взрослых (6-9 мес.) инъекционных химер проводился с использованием флуоресцентной и конфокальной микроскопии. Были исследованы образцы всех трёх зародышевых листков, всго 25 органов. Было проанализировано 5 химер групы Taf, 7 - группы Tef, 13 химер Tau-GFP и 1 химера из группы D3T14. Жизнеспособность химерных животных не отличалась от нормы, за исключением случаев возникновения спонтанных опухолей у 3 животных и аномального развития 1 животного группы Tef. Наблюдалось увеличение веса химер по мере взросления вследствие накопления большого количества жира. Потомки введённых клеток выявлены в группе Tau-GFP практически во всех органах, за исключением печени и слизистой оболочки кишечника. В группах Taf, Tef и D3T14 наблюдалась преимущественная колонизация мезодермальных производных, т.е. возможное снижение спектра дифференцировки производных гибридных ES-клеток.

Научный руководитель – канд. биол. наук Е. А. Кизилова

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ В-ХРОМОСОМ СИБИРСКОЙ КОСУЛИ

–  –  –

В или добавочные хромосомы выделяют в особый класс хромосом.

Они характеризуются необязательностью для жизнедеятельности организмов. Являются самыми нестабильными элементами генома. Отличаются необычным поведением в митозе и мейозе. Встречаются у грибов, растений и животных. В настоящее время известно, что добавочные элементы обладают гетерохроматиновой природой. В хромосомы богаты повторенной некодирующей ДНК. После обнаружения консервативных копий гена C-KIT на добавочных хромосомах лисиц и енотовидных собак [1] встал вопрос о присутствии других генов в В-хромосомах этих и других видов.

В нашем исследовании использовались тотальная библиотека последовательностей кДНК и библиотека сортированных В-хромосом, при гибридизации которых были отобраны кДНК последовательности, специфичные для добавочных хромосом сибирской косули (Capreolus pygargus, 2n=70+8B). Анализ библиотек кДНК показал наличие в В-хромосомах сибирской косули копий различных аутосомных генов. В связи с этим была поставлена цель подробного изучения молекулярной организации добавочных хромосом сибирской косули. Для этого проводилось картирование отдельных участков района хромосомы 1 косули, гомологичного соответствующему участку хромосомы 3 коровы. Для выявления протяженности и границ амплифицированных участков на В-хромосомах использовали ПЦР-картирование и гибридизацию ВАС клонов коровы на хромосомы косули. Удалось установить, что В-хромосомы сибирской косули содержат амплифицированный район размером около 740 т.п.н., гомологичный участку хромосомы 3 коровы (75.15–77.2 м.п.н.) и несущий такие важные гены как TNNI3K и LRR44.

_____________________________

9. S. Graphodatsky, A. Kukekova, D. Yudkin, V. Trifonov, et al. The proto-oncogene C-KIT maps to canid B-chromosomes, Chromosome Res. 13, 113-122 (2005).

Научный руководитель - канд. биол. наук В. А. Трифонов

ИЗУЧЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ХЛОРОФИЛЛА АФИЛЬНОГО ГОРОХА СОРТА ОРЛОВЧАНИН

–  –  –

Фотосинтез – основной процесс питания растений. Поэтому урожай растений, прежде всего, определяется размерами и продуктивностью работы фотосинтетического аппарата. Возможные подходы к получению растений с устойчивой продуктивностью неизменно привлекают внимание исследователей. Культура гороха характеризуется высокой полегаемостью и, вследствие этого, потерями урожая и сниженной продуктивностью, особенно в годы с высоким уровнем осадков. Учитывая это, генетики и селекционеры все чаще используют морфотипы с измененной морфологией листа.

Особое внимание уделяется афильному морфотипу, у которого в результате гомеозисной мутации по гену Af листочки преобразованы в усики. Благодаря сильному переплетению гипертрофированных усов посевы афильного гороха (генотип af) приобретает устойчивость к полеганию, что в свою очередь, снижает потери урожая. Известно, что одним из важных показателей определяющих биологическую продуктивность растения, по данным ряда авторов, является содержание хлорофилла в его тканях.



Pages:     | 1 | 2 || 4 |
Похожие работы:

«Министерство образования и науки РФ ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» Институт экологии и природопользования кафедра почвоведения Составитель К.Г. Гиниятуллин Статистическая обработка результатов научных исследований Кра...»

«Ученые записки Таврического национального университета им. В.И. Вернадского Серия «Биология, химия». 2007. Том 20 (59). № 1. С. 47-57. УДК 57.045 : 57.056 ИНДИВИДУАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ СВЯЗЕЙ ДИНАМИКИ...»

«ISSN 2224-5308 АЗАСТАН РЕСПУБЛИКАСЫ ЛТТЫ ЫЛЫМ АКАДЕМИЯСЫНЫ ХАБАРЛАРЫ ИЗВЕСТИЯ NEWS НАЦИОНАЛЬНОЙ АКАДЕМИИ НАУК OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН OF THE REPUBLIC OF KAZAKHSTAN БИОЛОГИЯ ЖНЕ МЕДИЦИНА СЕРИЯСЫ СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ И МЕДИЦИНСКАЯ SERIES OF BIOLOGICAL AND MEDICAL 1 (301) АНТАР – АПАН 2014 ж....»

«ФЛЕЕНКО Алена Викторовна РЕАЛИЗАЦИЯ ПРИНЦИПОВ ЭКОЛОГО-ГЕОГРАФИЧЕСКОГО ОБРАЗОВАНИЯ В ШКОЛЕ 25.00.36 – геоэкология (Науки о Земле) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата географических наук Томск – 2010 Работа выполнена на кафедре географии ГОУ ВПО «Томский государст...»

«ЛИТВИНОВА НАДЕЖДА АЛЕКСЕЕВНА РОЛЬ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ ПСИХОФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ СТУДЕНТОВ В АДАПТАЦИИ К УМСТВЕННОЙ И ФИЗИЧЕСКОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ 03.00.13 – физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биоло...»

«Химия растительного сырья. 2000. №2. С. 79–85. УДК 615.322:547.913(571) ИССЛЕДОВАНИЕ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА НАДЗЕМНОЙ ЧАСТИ МАНЖЕТКИ ОБЫКНОВЕННОЙ ALCHEMILLA VULGARIS L.S.L В.Ю. Андреева, Г.И. Калинкина * Сибирский государственный медицинский университет, Том...»

«2 Введение В основу настоящей программы положены следующие разделы: физикохимические основы биохимии; структура и физико-химические свойства низкомолекулярных соединений, входящих в состав...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Кемеровский государственный университет» Биологический факультет Утверждаю: Ректор КемГУ В.А. Волчек «» 2013 г. ОСНОВНАЯ ОБРАЗОВАТЕЛЬНАЯ...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК НОВОСИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ МАТЕРИАЛЫ XLI МЕЖДУНАРОДНОЙ НАУЧНОЙ СТУДЕНЧЕСКОЙ КОНФЕРЕНЦИИ «Студент и научно-технический прогресс» БИОЛОГИЯ Новосибирск УДК 54 ББК Г.я 431 Материалы ХLI...»

«Макарова Екатерина Леонидовна ЗАКОНОМЕРНОСТИ АДСОРБЦИОННОЙ ИММОБИЛИЗАЦИИ ГЛЮКОАМИЛАЗЫ НА БИОПОЛИМЕРАХ И УГЛЕРОДНЫХ НАНОТРУБКАХ Специальность 03. 01. 02. Биофизика Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук...»

«КАЗАНСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИНСТИТУТ ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ И БИОЛОГИИ Кафедра физиологии человека и животных ПСИХОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ПСИХИЧЕСКИХ ФУНКЦИЙ ЧЕЛОВЕКА Учебно-методическое пособие Казань – 2015 УДК 612.821 ББК 88 3 Принято на заседании кафедры физиологии ч...»

«ВЕСТНИК СВНЦ ДВО РАН 2012, №2, C. 69-77: УДК 582.29 (571.62) ЛИШАЙНИКИ ЛАНЖИНСКИХ ГОР (ОХОТИЯ) LICHENS OF LANZHINSKIYE MOUNTAINS (OKHOTIA) А.В. Великанов 1, И.Ф. Скирина 2 A.V. Velikanov1, I.F. Skirina2 Биолого...»

«Мамонтов Юрий Сергеевич ФЛОРА МОХОВИДНЫХ ОМСКОЙ ОБЛАСТИ 03.00.05 – «Ботаника» АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск – 2007 Работа выполнена на кафедре ботаники, цитологии и генетики ГОУ ВПО «Омский государственный педагогический университет» Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Борис Фёдорович Свириде...»

«Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского Серия «Биология, химия». Том 25 (64). 2012. № 2. С. 244-251. УДК 616.31-089:616.6:611-018.4:615.21:616-092.9 ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЭТИОЛОГИЧЕСКОГО ФАКТОРА, ВЫЗЫВАЮЩЕГО «ВИНТОВЫЕ ОСТЕОМИЛИТЫ», И ОЦЕНКА ЕГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА...»

«Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского Серия «Биология, химия». Том 19 (58). 2006. № 4. С. 135-141. УДК 612.821 ПСИХОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСО...»

«Министерство сельского хозяйства Российской Федерации Департамент научно-технологической политики и образования Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Красноярский государственный аграрный университет» Институт агроэкологических технологий Кафедры: общего земледелия, растениеводства и...»

«ПРОГРАММА КАНДИДАТСКОГО ЭКЗАМЕНА по специальности 02.00.10 «Биоорганическая химия» Часть 1. ПРОГРАММА-МИНИМУМ кандидатского экзамена по специальности 02.00.10 «Биоорганическая химия» по химическим, биологическим и техническим наукам Введение В основу настоящей программы положены важнейшие разделы биоорг...»

«Махонина Галина Ивановна НАЧАЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ ПОЧВООБРАЗОВАНИЯ В ТЕХНОГЕННЫХ ЭКОСИСТЕМАХ УРАЛА Специальность 03.00.27. – почвоведение Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Томск-2004 -3Работа выпо...»

«1 Цели и задачи дисциплины Целью освоения дисциплины «Проблемы повышения продуктивности полевых культур является научить аспирантов решать комплексные задачи в области агрономии на основе современных знаний по технологиям возделывания основных полевых культур, обеспечивающих максимальную реализацию биологиче...»

«ПРОГРАММА-МИНИМУМ кандидатского экзамена по специальности 05.13.18 «Математическое моделирование, численные методы и комплексы программ» по химическим, геолого-минералогическим и биологическим наукам Введение В основу настоящей программы положены следующие дисциплины: информатика; вычислительная математик...»

«Министерство здравоохранения и социального развития РФ ГОУ ВПО ИГМУ Кафедра фармакогнозии с курсом ботаники Методические указания для студентов 3 курса фармацевтического факультета Тема: Растения и сы...»

«ФЕВРАЛЬ 2014 Тема номера – Здоровье подростков По определению ВОЗ, подростковый возраст является периодом роста и развития человека, который следует после детства и длится до достижения зрелого возраста, то есть с 10 до 19 ле...»

«МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ УТВЕРЖДАЮ Первый заместитель министра Д.Л. Пиневич 13.04.2012 Регистрационный № 028-0212 МЕТОД ПСИХОТЕРАПИИ ПРИ ЛЕЧЕНИИ РЕЦИДИВИРУЮЩЕГО ПРОСТОГО ГЕРПЕСА инструкция по применению УЧРЕЖДЕНИЯ-РАЗРАБОТЧИКИ: ГУ «Республиканский научно-практический центр радиационной...»

«Международный Союз Радиоэкологии Департамент гражданской защиты населения Ханты-Мансийского автономного округа-Югры Институт экологии растений и животных УрО РАН Уральский научно-исследовательский ветеринарный институт Российская экологическая акад...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Владимирский государственный университет имени Александра Григорьевича и Николая Григорьевича Столетовых»...»

«ИСТОРИИ O НАУЧНЫХ ОЗАРЕНИЯХ (КНИГА 2) Владимир Соловьев: «Будьте внимательны с цифрой тринадцать. Она таит в себе много неожиданностей!» ИГОРЬ УШАКОВ В НАЧАЛЕ БЫЛО ЧИСЛО. Перевод с английского San Diego В начале было число. Дизайнер обложки: Кристина Ушакова Художник: Святослав Ушаков Перевод с английского...»








 
2017 www.pdf.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - разные матриалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.